本文關(guān)鍵詞：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及氣體治療急性肺損傷的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：ALI/ARDS在20世紀(jì)60年代首次被公認(rèn)為一種臨床綜合癥，表現(xiàn)為低氧血癥、雙肺浸潤的嚴(yán)重急性呼吸衰竭。引起ALI/ARDS的病因復(fù)雜，其中彌漫性肺部感染特別是革蘭氏陰性桿菌感染為最主要原因，而內(nèi)毒素（LPS）正是革蘭氏陰性桿菌感染的主要致病因素。ALI/ARDS當(dāng)前的治療方案主要是支持治療，給予肺保護(hù)性通氣以及藥物保守治療，而迄今為止的臨床試驗(yàn)所評價(jià)的大批治療藥物并沒有哪一種被證實(shí)是有效的，ALI/ARDS的死亡率仍高達(dá)40%。因此，創(chuàng)新的治療手段對于ALI/ARDS是十分必要的。 干細(xì)胞目前已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stemcells，MSC)因?yàn)槠淞己玫陌踩�，目前已�?jīng)成為臨床研究和應(yīng)用的主要細(xì)胞來源。因此，本研究首先構(gòu)建內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷模型，并獲取人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，擬探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷的治療作用、實(shí)際應(yīng)用研究、與臨床常用藥物的治療比較以及可能的治療機(jī)理。 因此，我們制定了如下的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法：一、構(gòu)建內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷模型：8-10周齡雌性C57BL/6小鼠，經(jīng)氣管內(nèi)給予LPS10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg劑量，分別觀察不同劑量下死亡率及肺部病理損傷。二、獲取無異種蛋白可臨床級應(yīng)用的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞：取新鮮臍帶組織，清洗、消化獲得間充質(zhì)干細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)，經(jīng)傳代擴(kuò)增后進(jìn)行表面標(biāo)記鑒定及分化鑒定，獲得符合間充質(zhì)干細(xì)胞生物特性的細(xì)胞。三、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUC-MSC）治療急性肺損傷的應(yīng)用及與甲強(qiáng)龍的治療比較：1.小鼠內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷模型造模成功后，給予小鼠尾靜脈移植hUC-MSC2×105，通過不同移植時(shí)間(0.5h、4h、24h)確定細(xì)胞移植有效時(shí)間窗。2.給予半數(shù)致死劑量LPS誘導(dǎo)小鼠內(nèi)毒素急性肺損傷模型，隨后給予小鼠不同劑量hUC-MSC（2×105、5×105、1×106）尾靜脈移植，以得出最佳細(xì)胞移植劑量。3.hUC-MSC與甲強(qiáng)龍治療急性肺損傷的比較研究：通過病理損傷（損傷評分）、肺組織濕干重比（W/D）、BALF中總細(xì)胞數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)、BALF總蛋白含量（BCA法）、BALF細(xì)胞因子含量（CBA法）、全肺細(xì)胞組分流式分析等指標(biāo)比較細(xì)胞與藥物治療的效果。 經(jīng)過實(shí)驗(yàn)我們成功構(gòu)建了氣管內(nèi)注射LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷模型，模型建立容易，肺損傷程度穩(wěn)定，符合臨床上感染性急性肺損傷的病理生理改變。通過給予LPS劑量的增加，小鼠死亡率及肺部病理損傷評分均相應(yīng)增加，且數(shù)值穩(wěn)定、均一，由此可根據(jù)對動物死亡率及肺部病理損傷程度的不同要求設(shè)計(jì)相應(yīng)實(shí)驗(yàn)。 我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，膠原酶消化獲得hUC-MSC單個(gè)細(xì)胞，通過人間充質(zhì)無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)原代后，細(xì)胞數(shù)量得到倍數(shù)擴(kuò)增，并經(jīng)多次傳代后，細(xì)胞純度提高，，形態(tài)穩(wěn)定均一，仍具有MSC典型成纖維樣、長梭形、旋渦狀生長特點(diǎn)及無限擴(kuò)增能力。培養(yǎng)至P4代細(xì)胞表面不同特異抗原仍具有穩(wěn)定表達(dá)，高表達(dá)MSC細(xì)胞特異標(biāo)志CD44、CD73、CD90、CD105及HLA-ABC，不表達(dá)造血細(xì)胞表面標(biāo)志CD14、CD34、CD45及不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志HLA-DR。通過體外特異培養(yǎng)基誘導(dǎo)hUC-MSC分化成骨、成脂，結(jié)果提示我們的hUC-MSC在P4代仍具有較強(qiáng)的分化能力。從形態(tài)、表面標(biāo)志抗原及分化能力等不同結(jié)果分析，實(shí)驗(yàn)獲得的hUC-MSC具有成體間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性。 進(jìn)一步研究我們發(fā)現(xiàn)，小鼠內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷模型造模成功后，分別于0.5h、4h、24h給予2×105hUC-MSC尾靜脈移植，48h后觀察實(shí)驗(yàn)動物病理損傷程度。結(jié)果顯示在致傷后0.5小時(shí)、4小時(shí)及24小時(shí)給予人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞2×105尾靜脈移植治療均可減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肺組織病理損傷，說明致傷后0.5h-24h均為有效治療時(shí)間。 而當(dāng)給予半數(shù)致死劑量LPS造模后，分別給予PBS以及不同劑量hUC-MSC（2×105、5×105、1×106）尾靜脈移植，48h后觀察實(shí)驗(yàn)動物死亡率及病理損傷程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在同等造模劑量并同時(shí)給予細(xì)胞移植情況下，hUC-MSC2x105劑量下對于小鼠有保護(hù)作用，肺部組織病理損傷明顯減輕，小鼠死亡率降低，對于急性肺損傷有明顯的治療效果，而隨著hUC-MSC移植劑量的增大，保護(hù)效果逐漸減弱，病理損傷評分增加，甚至增加了死亡率。 小鼠內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷模型造模成功后，于造模后24h分別給予PBS、hUC-MSC、甲強(qiáng)龍(Drug)、hUC-MSC+甲強(qiáng)龍(hUC-MSC+Drug)尾靜脈移植治療。48h后觀察實(shí)驗(yàn)動物病理損傷程度，可見小鼠致傷后給予hUC-MSC、甲強(qiáng)龍以及hUC-MSC與甲強(qiáng)龍聯(lián)合治療均有效減輕了肺組織病理損傷。從損傷評分來看，hUCMSC與甲強(qiáng)龍聯(lián)合治療效果最好，損傷評分最低，但是與單獨(dú)應(yīng)用hUCMSC或甲強(qiáng)龍組比較并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其效果并未優(yōu)于其他兩組。 小鼠致傷后給予hUC-MSC、甲強(qiáng)龍以及hUC-MSC與甲強(qiáng)龍聯(lián)合治療，各治療組肺組織濕干重比均較PBS對照組有所下降，hUC-MSC組與聯(lián)合治療組均有顯著差異，甲強(qiáng)龍治療組濕干重比與PBS對照組比略低，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 小鼠內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷后給予hUC-MSC、甲強(qiáng)龍以及hUC-MSC與甲強(qiáng)龍聯(lián)合治療，與PBS對照組相比，各治療組BALF細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比及中性粒細(xì)胞數(shù)均明顯下降，有顯著性差異，說明各組治療均可減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷的炎癥反應(yīng)。各治療組BALF中總蛋白含量明顯降低，其中甲強(qiáng)龍+hUC-MSC組總蛋白含量最低，hUC-MSC組次之，甲強(qiáng)龍組略高，但三組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 肺損傷后給予hUC-MSC、甲強(qiáng)龍、甲強(qiáng)龍+hUC-MSC各組治療后，BALF中TNF、IL-6含量明顯降低，IFN-γ、IL-10、MCP-1、IL-12無明顯變化，在三組治療中，聯(lián)合治療組并未比單獨(dú)應(yīng)用hUC-MSC或甲強(qiáng)龍?jiān)谘装Y因子調(diào)節(jié)方面取得更好效果。 肺損傷后給予PBS、hUC-MSC、甲強(qiáng)龍治療，觀察2d、7d、14d、28d各時(shí)間點(diǎn)CD45-CD31+細(xì)胞群（內(nèi)皮細(xì)胞）、CD45+細(xì)胞群（白細(xì)胞）、CD31-CD45-EpCAM+細(xì)胞群（上皮細(xì)胞）、CD31-CD45-EpCAM-Sca1+細(xì)胞群（間質(zhì)細(xì)胞）、CD31-CD45-CD24lowEpCAMhi細(xì)胞群（上皮干祖細(xì)胞）各群細(xì)胞組分變化。結(jié)果表明，與PBS組比較，2d時(shí)甲強(qiáng)龍組CD45+細(xì)胞群（白細(xì)胞）顯著減少，而hUC-MSC組并不引起任何細(xì)胞組分變化；除CD45+群細(xì)胞外，其他各群細(xì)胞均無明顯改變，且7d、14d、28d各治療組各群細(xì)胞亦區(qū)別不大，由此考慮藥物治療的部分機(jī)制為通過降低了CD45+細(xì)胞群（白細(xì)胞）而減輕炎癥反應(yīng)，而hUC-MSC的治療則并非通過改變細(xì)胞組分而起效。 基于以上動物模型及實(shí)驗(yàn)方法，除了主要進(jìn)行的hUC-MSC治療急性肺損傷的研究外，同時(shí)還與天津醫(yī)科大學(xué)謝克亮博士共同進(jìn)行了NO和H2治療急性肺損傷的部分研究。 由此我們得出如下結(jié)論： 一、成功構(gòu)建了穩(wěn)定的小鼠內(nèi)毒素急性肺損傷模型 二、成功獲得了無異種蛋白的人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞，大大降低了細(xì)胞免疫原性，對未來臨床及組織工程等多方面應(yīng)用提供了更有利的基礎(chǔ)及安全保障。 三、1.從臨床實(shí)際應(yīng)用出發(fā)，摸索了急性肺損傷的有效治療時(shí)間窗及最佳細(xì)胞移植劑量，在內(nèi)毒素急性肺損傷的治療方面目前尚無同類研究； 2.在內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷的治療相關(guān)研究中，明確了人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療急性肺損傷有顯著效果，并首次將細(xì)胞治療與目前臨床常用藥物甲強(qiáng)龍做比較，二者治療急性肺損傷均有顯著療效，但療效比較并無差異，且二者聯(lián)用并無協(xié)同作用，此方面研究目前尚無相關(guān)報(bào)道。 3.在急性肺損傷的治療研究中，首次利用流式細(xì)胞技術(shù)分析各治療組全肺細(xì)胞組分，明確了hUC-MSC對急性肺損傷的治療作用并非通過改變細(xì)胞成分而起作用，為今后關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞治療急性肺損傷的機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。 四、2%H2或/和0.004%NO通過減少炎癥和細(xì)胞凋亡明顯減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷，這可能與NF-κB活性下降相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R563.8

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本文編號：1245831