本文關鍵詞：特發(fā)性間質(zhì)性肺炎患者下呼吸道菌群結構研究

  更多相關文章： 微生物DNA提取 支氣管肺泡灌洗液 宏基因組 IIPs 微生物群落 支氣管肺泡灌洗液 宏基因組

【摘要】：第一部分[研究目的]探索一種優(yōu)化的下呼吸道微生物DNA提取方法。[研究方法](1)入選IIPs患者,共2例,收集所有研究對象的支氣管肺泡灌洗液標本。將每個研究對象的BALF標本等分為2份,根據(jù)支氣管肺泡灌洗液標本處理方式的不同分為：新鮮樣本組和冷凍樣本組。新鮮樣本組標本采集后,立即行微生物DNA提取。冷凍樣本組標本經(jīng)預處理后,保存于-80℃冰箱,擇日行微生物DNA提取。(2)入選IIPs患者,共12例,收集所有研究對象的支氣管肺泡灌洗液標本和漱口水樣本。將所有研究對象按采用的DNA提取方案隨機分為kit1組,kit2組和kit3組,其中BALF樣本標記為A,漱口水樣本標記為B。根據(jù)試劑盒說明書提取樣本中微生物DNA。(3)采用Ⅲumina宏基因組DNA文庫構建改良法構建DNA文庫,采用Hiseq2500二代高通量測序平臺行宏基因組測序。將下機宏基因組測序原始數(shù)據(jù)上傳至MG-RAST進行物種比對和基因注釋。[結果](1)與新鮮BALF樣品相比,由冷凍BALF樣品提取得到的DNA中人類基因組比率較低[患者1：59.80%(冷凍BALF樣品)和68.60%(新鮮BALF樣品),患者2：47.91%(冷凍BALF樣品)和66.89%(新鮮BALF樣品)]；對于來自同一個體的樣本,對于同一數(shù)據(jù)庫的比對結果,冷凍樣本可比對上的測序片段數(shù)多于新鮮樣本；來自同一個體的冷凍樣品與新鮮樣品的豐度排在前50位的門類構成間有微小差異；對于來自同一個體的樣本,新鮮BALF樣本與冷凍BALF樣本的主要菌群結構無顯著性統(tǒng)計學差異。(2)采用含有Benzonase的試劑盒(kit1)純化得到的BALF或漱口水的DNA產(chǎn)物濃度均低于另外兩個試劑盒純化得到的DNA濃度；采用含有Benzonase的試劑盒(kit1)純化得到的DNA產(chǎn)物中人源化DNA所占比例顯著低于kit2和kit3純化得到的DNA產(chǎn)物；kit1A組的細菌的豐富度比kit2A和kit3A組(豐富度：P=0.009)顯著較高。[結論]采用-80℃低溫冷凍保藏技術處理BALF標本,可以得到含較高比例微生物DNA的DNA提取物,不會影響細菌群落結構；采用Benzonase預處理BALF標本,可以顯著降低DNA產(chǎn)物中宿主DNA的比例,不會影響細菌群落結構。第二部分[研究目的]識別并比較健康肺和ⅡPs患者的下呼吸道菌群結構特點。[研究方法](1)入選38例對照者(對照組：15例吸煙者,23例非吸煙者)和17例ⅡPs患者(病例組),收集所有研究對象的支氣管肺泡灌洗液標本。采用QIAamp DNA Microbiome Kit行微生物DNA提取。(2)采用Illumina宏基因組DNA文庫構建改良法構建DNA文庫,采用Hiseq2500二代高通量測序平臺行宏基因組測序。(3)將下機宏基因組測序原始數(shù)據(jù)上傳至MG-RAST進行物種比對和基因注釋。[結果]變形菌門為健康肺和IIPs患者下呼吸道主要優(yōu)勢菌門,其次為厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門。在菌屬水平上,與對照組相比,病例組柄桿菌屬、嗜血桿菌屬和擬桿菌屬顯著較低,無色桿菌屬、鮑特菌屬和紅球菌屬顯著增高；病例組有6個菌種的相對豐度顯著較高(Achromobacter xylosoxidans Methylobacterium extorquens、 Achromobacter piechaudii、 Bordetella bronchiseptica、 Bordetella parapertussis和Rhodococcus erythropolis),7個菌種水平顯著降低(Actinomyces odontolyticus、 Phenylobacterium zucineum、 Neisseria meningitidis、 Caulobacter vibrioides、 Caulobacter sp. K31、 Haemophilus influenza 和 Caulobacter sp.) .丙酸桿菌屬相對豐度與血C反應蛋白濃度呈顯著負相關,假單胞菌屬和伯克氏菌屬與血沉及FEV1/FVC%顯著負相關,與FVC%、 FEV1%、 VC%和FEV1顯著正相關；慢生型大豆根瘤菌屬與FEV1/FVC%顯著負相關；普雷沃菌屬與FEV1/FVC%顯著正相關,與FEV1顯著負相關。[結論]IIPs患者下呼吸道的主要菌門構成可能與健康人群類似；IIPs患者下呼吸道的菌屬和菌種結構失調(diào),且某些菌屬與限制性通氣功能障礙和炎性因子間顯著相關。
【關鍵詞】：微生物DNA提取 支氣管肺泡灌洗液 宏基因組 IIPs 微生物群落 支氣管肺泡灌洗液 宏基因組
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R56
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-9
• 符號說明9-10
• 前言10-14
• 第一部分 BALF樣本微生物DNA提取的方法學研究14-49
• 材料與方法14-28
• 結果28-44
• 討論44-48
• 結論48-49
• 第二部分 比較健康肺與IIPs患者下呼吸道菌群結構的研究49-78
• 材料與方法49-59
• 結果59-72
• 討論72-77
• 結論77-78
• 參考文獻78-85
• 附錄85-105
• 綜述105-113
• 參考文獻110-113
• 致謝113-114

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本文編號：1093431