本文關(guān)鍵詞：NLRP3炎癥體參與A549細(xì)胞分泌IL-1β、IL-18的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(acute lung injury/acute respiratory distress syndrome,ALI/ARDS)是臨床常見的危重癥,盡管近年來治療手段有所發(fā)展,然而病死率仍較高[1-3]。有關(guān)ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明,但是目前認(rèn)為炎癥反應(yīng)失衡在其發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用,而有關(guān)炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生釋放機(jī)制目前仍未完全闡明。白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素18(interleukin-18,IL-18)是ALI/ARDS發(fā)展過程中較為重要的炎性介質(zhì),目前研究表明,IL-1β、IL-18的產(chǎn)生受NLRP3炎癥體通路的調(diào)控[4,5]。NLRP3炎癥體是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的多蛋白復(fù)合體,其組件包括核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)、凋亡相關(guān)微粒蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase1)共同組成[6]。其可以識(shí)別多種病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMPs),比如脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),或者損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern,DAMPs),比如三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP),從而由靜止形式轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨问?進(jìn)而促進(jìn)IL-1β和IL-18釋放[7]。研究表明肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞中存在NLRP3炎癥體通路,且其活化以后參與了ALI的發(fā)生發(fā)展[8,9],然而在肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cells,AEC)是否也存在NLRP3炎癥體通路,該通路能否在LPS的刺激下活化并釋放炎性介質(zhì)IL-1β、IL-18目前尚未見明確研究報(bào)道。鑒于此,本課題以肺泡上皮來源的A549細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,觀察其是否存在NLRP3炎癥體通路,并探討LPS或LPS聯(lián)合ATP刺激后NLRP3炎癥體通路蛋白表達(dá)及細(xì)胞因子IL-1β、IL-18分泌情況,并明確A549細(xì)胞IL-1β、IL-18的分泌是否與NLRP3炎癥體有關(guān)。目的:探討肺上皮來源A549細(xì)胞在LPS或LPS聯(lián)合ATP刺激后NLRP3炎癥體通路蛋白表達(dá)及細(xì)胞因子IL-1β、IL-18分泌情況,初步了解NLRP3炎癥體通路在人肺上皮來源A549細(xì)胞中的作用及機(jī)制。研究方法:1.A549細(xì)胞內(nèi)NLRP3/ASC/caspase-1炎癥體m RNA及蛋白表達(dá)以人肺上皮來源A549細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,采用RT-PCR、Western blot檢測(cè)A549細(xì)胞是否存在NLRP3/ASC/caspase-1m RNA及蛋白水平表達(dá)。2.LPS對(duì)A549細(xì)胞NLRP3炎癥體通路相關(guān)m RNA及蛋白表達(dá)的影響予以不同濃度LPS(0,1,5,10,50,100μg/ml)刺激A549細(xì)胞相同時(shí)間及相同濃度LPS(10μg/ml)刺激不同時(shí)間(0h,3h,6h,12h,24h,48h),RT-PCR技術(shù)檢測(cè)LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞NLRP3、caspase-1m RNA的表達(dá)情況,Western blot探討LPS是否能激活NLRP3炎癥體及其激活的最佳時(shí)間和濃度。3.LPS聯(lián)合ATP處理對(duì)A549細(xì)胞NLRP3炎癥體通路蛋白表達(dá)的影響根據(jù)LPS刺激A549細(xì)胞后,NLRP3炎癥體通路蛋白表達(dá)的時(shí)效與量效關(guān)系,選定10μg/ml LPS先預(yù)激細(xì)胞6h,再給以0mmol/L,0.5mmol/L,1mmol/L,2mmol/L,4mmol/L ATP刺激1h,Western blot檢測(cè)LPS聯(lián)合ATP刺激是否能激活A(yù)549細(xì)胞的NLRP3炎癥體通路。4.不同刺激條件對(duì)A549細(xì)胞caspase-1活性及IL-1β、IL-18分泌的影響將實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、LPS單獨(dú)刺激組、ATP單獨(dú)刺激組、LPS聯(lián)合ATP刺激組,caspase-1活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)caspase-1活性,Western blot、ELISA技術(shù)分別檢測(cè)NLRP3炎癥體通路蛋白表達(dá)及IL-1β、IL-18分泌情況,。5.NLRP3-si RNA干擾對(duì)LPS聯(lián)合ATP誘導(dǎo)的A549細(xì)胞分泌IL-1β、IL-18的影響采用NLRP3-si RNA下調(diào)NLRP3基因表達(dá)后,ELISA檢測(cè)LPS聯(lián)合ATP刺激A549細(xì)胞后細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-18濃度變化。結(jié)果:1.A549細(xì)胞中存在NLRP3炎癥體各組件NLRP3、ASC、caspase-1m RNA及蛋白水平的表達(dá)。2.與對(duì)照組相比,LPS單獨(dú)處理組可誘導(dǎo)A549細(xì)胞NLRP3、caspase-1m RNA及NLRP3、caspase-1、pro-IL-1β蛋白表達(dá)升高(P0.05),且表達(dá)量具有LPS時(shí)間和劑量依賴性,但是不能誘導(dǎo)活化形式的caspase-1p20蛋白表達(dá)及細(xì)胞因子IL-1β、IL-18的分泌(P0.05),3.與對(duì)照組相比,ATP單獨(dú)刺激組不引起NLRP3、caspase-1 p45、caspase-1p20、pro-IL-β蛋白表達(dá)變化及IL-1β、IL-18分泌(P0.05)。4.與LPS單獨(dú)刺激組相比,LPS聯(lián)合ATP刺激組檢測(cè)到活化形式的caspase-1p20蛋白表達(dá)及IL-1β、IL-18的分泌(P0.05)。與對(duì)照組、LPS單獨(dú)刺激組和ATP單獨(dú)刺激組相比,LPS聯(lián)合ATP刺激組A549細(xì)胞caspase-1活性最強(qiáng)(P0.05),對(duì)照組、LPS單獨(dú)刺激組和ATP單獨(dú)刺激組之間caspase-1活性無差異(P0.05)。5.采用NLRP3-si RNA下調(diào)NLRP3基因表達(dá),可抑制LPS聯(lián)合ATP誘導(dǎo)的A549細(xì)胞IL-1β、IL-18的分泌。結(jié)論:1.在肺上皮來源A549細(xì)胞中存在NLRP3炎癥體通路。2.LPS可上調(diào)NLRP3炎癥體通路NLRP3m RNA、caspase-1m RNA及NLRP3、caspase-1、pro-IL-1β蛋白表達(dá),但是不能活化NLRP3炎癥體,單獨(dú)的ATP既不能上調(diào)NLRP3炎癥體通路蛋白表達(dá),也不能活化NLRP3炎癥體。3.LPS聯(lián)合ATP刺激A549細(xì)胞可活化NLRP3炎癥體,表現(xiàn)為活性形式的caspase-1p20蛋白的表達(dá)、活性形式的IL-1β、IL-18分泌、caspase-1活性增強(qiáng),提示A549細(xì)胞中NLRP3炎癥體的完全激活可能需要兩種不同刺激因素的參與。3.LPS聯(lián)合ATP誘導(dǎo)A549細(xì)胞分泌的炎性因子IL-1β、IL-18在下調(diào)NLRP3基因以后顯著減少,初步提示IL-1β、IL-18的分泌可能是受NLRP3炎癥體途徑調(diào)控。綜合上述結(jié)果,本課題對(duì)來源于肺上皮的A549細(xì)胞內(nèi)的NLRP3炎癥體通路表達(dá)及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行的初步的觀察和研究,為深入研究NLRP3炎癥體在ARDS等肺部炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程對(duì)肺泡上皮細(xì)胞的作用及具體機(jī)制奠定了一定的理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：NLRP3 炎癥體 三磷酸腺苷 脂多糖 A549細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R563
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-5
• 英文摘要5-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 A549細(xì)胞中NLRP3/ASC/caspase-1 炎癥體m RNA及蛋白表達(dá)水平14-25
• 2.1 材料與方法14-22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果22-23
• 2.3 討論23-24
• 2.4 小結(jié)24-25
• 第三章 LPS、ATP體外處理對(duì)A549細(xì)胞NLRP3炎癥體及炎癥因子IL-1β、IL-18表達(dá)水平的影響25-43
• 3.1 材料與方法25-31
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-39
• 3.3 討論39-41
• 3.4 小結(jié)41-43
• 全文結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-48
• 文獻(xiàn)綜述 NLRP3炎癥體參與肺部常見疾病發(fā)生的研究及其進(jìn)展48-61
• 參考文獻(xiàn)56-61
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文61-62
• 致謝62

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本文編號(hào)：1071908