發(fā)布時間：2017-06-10 19:15

  本文關(guān)鍵詞：肝素—超氧化物歧化酶結(jié)合物（Hep-SOD）防治輻射損傷作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：隨著醫(yī)療技術(shù)的快速發(fā)展,日益精密先進(jìn)的放射療法在腫瘤治療領(lǐng)域發(fā)揮著舉足輕重的作用。然而,腫瘤周圍的正常組織損傷始終是一個無法根本克服的難題,很大程度上阻礙了放療的進(jìn)一步深化應(yīng)用。為了有針對性地研究出高效低毒的輻射保護(hù)劑,首先需要了解輻射損傷的產(chǎn)生機(jī)理。目前被廣泛接受的是一種氧化應(yīng)激損傷學(xué)說,該學(xué)說認(rèn)為輻射作用于機(jī)體后,誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生過量活性氧類物質(zhì)(reactive oxygen species, ROS),后者靶向損害DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等生物大分子進(jìn)而引起相關(guān)組織功能異常,產(chǎn)生損傷效應(yīng)。其中,ROS家族包含了多個成員,超氧自由基(superoxide radical, O2)最先產(chǎn)生并通過后續(xù)反應(yīng)可誘發(fā)多種其它ROS�？梢�,清除O2-緩解輻射損傷起著關(guān)鍵作用。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)是體內(nèi)唯一特異性歧化O2-的酶,但是其直接藥用存在易降解、穩(wěn)定性差、半衰期短等不足。為提高此類酶類藥物在體內(nèi)的生物利用度,化學(xué)修飾是常用的方法之一。我們在此采用功能性黏多糖肝素作為修飾劑,旨在改善蛋白質(zhì)藥物的自身不足,同時也能整合多種生物學(xué)功能,從而協(xié)同其藥效的發(fā)揮。本課題中,我們借鑒前人研究基礎(chǔ),先后分離純化SOD原料并制備出肝素修飾SOD結(jié)合物(Hep-SOD)。通過SDS-PAGE、Native-PAGE、SEC-HPLC、連苯三酚自氧化速率測定法及凝膠滲透色譜-多角度激光散射技術(shù)檢測SOD及Hep-SOD的純度、酶比活、分子量等。運(yùn)用優(yōu)化的MTT法于體外初步評價Hep-SOD對小鼠肺成纖維細(xì)胞L929的輻射防護(hù)作用。采用總SOD測試盒檢測小鼠外周血中酶活性和Hep-SOD的基本藥代動力學(xué)參數(shù)。參考抗輻射藥物的臨床前試驗指導(dǎo)原則,在小鼠全身水平開展Hep-SOD對輻射損傷防護(hù)作用的體內(nèi)評價。 1.豬血SOD原料的分離純化 借鑒前人研究基礎(chǔ),采用DEAE-Sepharose Fast Flow對豬血SOD原料進(jìn)行分離純化。聯(lián)合SDS-PAGE和SEC-HPLC對SOD純化產(chǎn)品進(jìn)行純度的定性和定量檢測。結(jié)果表明DEAE-Sepharose Fast Flow一步法可將SOD的純度由87%提高到100%左右。聯(lián)合BCA蛋白定量和微量連苯三酚自氧化速率法測定活性,純化后SOD的酶比活由3076u/mg prot提高到4614u/mg prot。 2.肝素修飾SOD結(jié)合物(Hep-SOD)的制備及其純度和分子量的測定 借鑒前人研究基礎(chǔ),先后經(jīng)過肝素活化、結(jié)合反應(yīng)及Q-Sepharose Fast Flow分離純化制備Hep-SOD。采用三硝基苯磺酸法(TNBS法)檢測出SOD的平均自由氨基修飾率為32%。通過SDS-PAGE和Native-PAGE檢測,發(fā)現(xiàn)分離純化出兩種修飾率不同的Hep-SOD,分別為Hep-SOD1和Hep-SOD2。與未修飾SOD相比,Hep-SOD1酶比活保留率為68%,Hep-SOD2的酶比活保留率為40%。借助凝膠滲透-多角度激光散射技術(shù),測得兩者的重均分子量(Mw)分別為49.69kDa和61.07kDa。 3. Hep-SOD對小鼠L929細(xì)胞輻射防護(hù)作用的體外評價 先后對L929細(xì)胞接種密度、產(chǎn)生敏感性照射劑量及照射后檢測時間進(jìn)行篩選,結(jié)果表明L929按每孔2000個細(xì)胞進(jìn)行接種,于照后48h進(jìn)行MTT檢測,可對4Gy的X射線產(chǎn)生顯著的輻射敏感性。同時,Hep-SOD用藥劑量的篩選結(jié)果顯示：可能源于較高的肝索修飾率,Hep-SOD2的安全劑量范圍較窄,僅在500～0μg/ml(即112.5～0U/m1)范圍無細(xì)胞毒作作用；而Hep-SOD1在考察的劑量范圍1000～0μg/ml(即990～0U/m1)內(nèi)均無細(xì)胞毒作用。為方便比較,我們統(tǒng)考察112.5U/ml的Hep-SOD1和Hep-SOD2分別在照前給藥和照后給藥對L929細(xì)胞的輻射防護(hù)作用。結(jié)果表明：二者照前給藥的防護(hù)作用突出,相對細(xì)胞活力與正常對照組相比無顯著差異；而照后給藥則無此作用。 4. Hep-SOD在小鼠體內(nèi)基本藥代動力學(xué)參數(shù)的測定 對小鼠采用腹腔注射，，于給藥后不同時間點(diǎn)采血,利用總SOD測試盒檢測小鼠外周血中酶活性,并結(jié)合相關(guān)軟件分析。結(jié)果表明：Hep-SOD在小鼠體內(nèi)藥動學(xué)行為符合二室模型；Hep-SOD1和Hep-SOD2較術(shù)修飾SOD體內(nèi)半衰期均顯著延長,尤其是Hep-SOD2的平均滯留時間(MRT)由SOD的(10.28±0.98)h顯著延長到了(22.86±3.37)h,表現(xiàn)出更高的生物利用度逆。 5. Hep-SOD對小鼠輻射防護(hù)作用的體內(nèi)評價 基于Hep-SOD體外評價和基本藥代動力學(xué)參數(shù)的測定結(jié)果,在此著重選擇具備一定輻射防護(hù)效果和較高生物利用度的Hep-SOD2(為簡便起見,下文更換名稱為Hep-SOD)進(jìn)行本章的體內(nèi)藥效評價。具體參考抗輻射藥物的臨床前試驗指導(dǎo)原則,系統(tǒng)考察Hep-SOD在受照小鼠全身水平的輻射防護(hù)作用。結(jié)果顯不：Hep-SOD可有效緩解輻射誘發(fā)的骨髓抑制；預(yù)防組織器官(尤其是肺組織)的氧化應(yīng)激損傷；阻止輻射導(dǎo)致的外周血谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)的異常升高；減輕小鼠肝組織、肺組織及小腸組織的結(jié)構(gòu)病變；整體表現(xiàn)較好的輻射損傷防護(hù)作用。但胸腺DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示照前給藥有加劇DNA損傷的可能。綜上可知,我們對輻射損傷的產(chǎn)生和Hep-SOD防護(hù)作用機(jī)理的認(rèn)識還有待進(jìn)一步加深。 本研究取得結(jié)果和結(jié)論： (1)運(yùn)用凝膠滲透-多角度激光散射光譜技術(shù)測得Hep-SOD重均分子量。 (2) Hep-SOD于照射前給藥對小鼠肺成纖維細(xì)胞L929可表現(xiàn)較好的輻射損傷防護(hù)作用。 (3)SOD經(jīng)肝素化修飾后體內(nèi)保留時間顯著延長,生物利用度明顯提高；且隨其自由氨基修飾率的提高,Hep-SOD表現(xiàn)更好的藥代動力學(xué)性質(zhì)。 (4)在小鼠輻射損傷模型試驗中,Hep-SOD可有效減輕輻射誘發(fā)的骨髓抑制,緩解肝組織和肺組織的氧化應(yīng)激損傷,且抑制肝、肺和小腸的病理形態(tài)變化。但是,結(jié)果同樣顯示Hep-SOD照射前給藥可能加劇DNA損傷,這為我們?nèi)嫜芯枯椛鋼p傷的產(chǎn)生及Hep-SOD的作用機(jī)制指明了新的方向。
【關(guān)鍵詞】：超氧化物歧化酶 肝素 肝素-超氧化物歧化酶結(jié)合物 凝膠滲透-多角度激光散射光譜技術(shù) MTT檢測 藥代動力學(xué)參數(shù) 輻射損傷
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R818.05;R96
【目錄】：

• 摘要16-19
• ABSTRACT19-23
• 符號說明23-26
• 第一章 前言26-39
• 1 活性氧類物質(zhì)(reactive oxygen species,ROS)26
• 2 輻射與輻射損傷26-28
• 3 輻射保護(hù)劑的研究28
• 4 超氧化物歧化酶(SOD)及其輻射保護(hù)作用的研究28-34
• 4.1 超氧化物歧化酶28-30
• 4.2 SOD的輻射保護(hù)作用研究30-34
• 4.2.1 組織或器官水平的輻射保護(hù)作用30-31
• 4.2.2 細(xì)胞水平的輻射保護(hù)作用31-33
• 4.2.3 分子水平的輻射保護(hù)作用33-34
• 5 超氧化物歧化酶的自身局限性與解決辦法34-35
• 5.1 SOD的自身局限性34
• 5.2 改善SOD不足的解決辦法34-35
• 5.2.1 轉(zhuǎn)基因治療34
• 5.2.2 非肽模擬類似物34-35
• 5.2.3 化學(xué)修飾35
• 6 肝素修飾SOD的可行性35-38
• 6.1 肝素的生物活性35-37
• 6.1.1 抗血栓36
• 6.1.2 抗炎36-37
• 6.1.3 降血脂37
• 6.1.4 抗癌37
• 6.1.5 抗氧化37
• 6.2 前期研究基礎(chǔ)37-38
• 7 本課題擬解決問題38-39
• 第二章 超氧化物歧化酶原料的分離純化39-48
• 1 材料39-40
• 1.1 試劑39
• 1.2 儀器39-40
• 2 方法40-42
• 2.1 DEAE-Sepharose Fast Flow凝膠色潛柱對SOD的分離純化40
• 2.2 樣品的超濾脫鹽40
• 2.3 SOD的SDS-PAGE檢測40-41
• 2.4 SOD的SEC-HPLC檢測41
• 2.5 SOD的蛋白質(zhì)含量測定41
• 2.6 SOD的酶活測定41-42
• 3 結(jié)果42-45
• 3.1 SOD的分離純化42-43
• 3.2 SOD的SDS-PAGE分析43
• 3.3 SOD的SEC-HPLC檢測43-44
• 3.4 SOD的酶活檢測44-45
• 4 討論45-47
• 4.1 SOD的分離純化45
• 4.2 蛋白含量測定方法的選擇45-46
• 4.3 酶活測定方法的選擇46-47
• 5 結(jié)論47-48
• 第三章 肝素-超氧化物歧化酶結(jié)合物(Hep-SOD)的制備及其純度與分子量的測定48-61
• 1 材料48-49
• 1.1 試劑48
• 1.2 儀器48-49
• 2 方法49-51
• 2.1 肝素的活化49
• 2.2 肝素與SOD的結(jié)合反應(yīng)49
• 2.3 SOD平均自由氨基修飾率的測定49
• 2.4 Q-Sepharose Fast Flow凝膠色譜柱對Hep-SOD的分離純化49-50
• 2.5 樣品的超濾脫鹽50
• 2.6 Hep-SOD的電泳檢測50
• 2.7 Hep-SOD的分子量檢測50-51
• 2.8 Hep-SOD的酶活測定51
• 3 結(jié)果51-57
• 3.1 SOD平均自由氨基修飾率51
• 3.2 修飾反應(yīng)液的電泳檢測51-52
• 3.3 修飾反應(yīng)液的分離純化52
• 3.4 修飾反應(yīng)液分離純化產(chǎn)物的Native-PAGE52-53
• 3.5 Hep-SOD分子量測定53-57
• 3.5.1 純化SOD的多角度激光散射圖譜53-54
• 3.5.2 肝素的多角度激光散射圖譜54-55
• 3.5.3 Hep-SOD的多角度激光散射圖譜55-57
• 3.6 Hep-SOD酶活測定57
• 4 討論57-60
• 4.1 肝素對SOD的化學(xué)修飾57-58
• 4.2 Hep-SOD的分離純化58-59
• 4.3 肝素化修飾對SOD活性的影響59
• 4.4 Hep-SOD分子量分布59-60
• 5 結(jié)論60-61
• 第四章 肝素-超氧化物歧化酶結(jié)合物(Hep-SOD)輻射防護(hù)作用的體外研究61-69
• 1 材料61-62
• 1.1 試劑61
• 1.2 細(xì)胞株61
• 1.3 儀器61-62
• 2 方法62-64
• 2.1 L929細(xì)胞的傳代及培養(yǎng)62
• 2.2 MTT法評價Hep-SOD對L929細(xì)胞的輻射防護(hù)作用62-64
• 2.2.1 細(xì)胞接種密度、敏感性照射劑量及照后檢測時間的篩選62
• 2.2.2 Hep-SOD用藥劑量的篩選62-63
• 2.2.3 Hep-SOD對L929細(xì)胞輻射防護(hù)作用的評價63-64
• 2.2.3.1 照前給藥作用評價63
• 2.2.3.2 照后給藥作用評價63-64
• 2.3 數(shù)據(jù)處理64
• 3 結(jié)果64-68
• 3.1 細(xì)胞接種密度、敏感性照射劑量及照射后檢測時間的篩選64-65
• 3.1.1 照后24h檢測結(jié)果64
• 3.1.2 照后48h檢測結(jié)果64-65
• 3.2 藥物劑量的篩選65-66
• 3.3 藥物輻射防護(hù)作用評價66-68
• 4. 討論68
• 5 結(jié)論68-69
• 第五章 肝素-超氧化物歧化酶結(jié)合物(Hep-SOD)基本藥代動力學(xué)參數(shù)的測定69-74
• 1 材料69-70
• 1.1 試劑69
• 1.2 儀器69
• 1.3 動物69-70
• 2 方法70
• 2.1 抗凝EEP管制作70
• 2.2 動物分組、給藥及取血70
• 2.3 小鼠外周血漿酶活測定70
• 2.4 數(shù)據(jù)處理70
• 3 結(jié)果70-72
• 4 討論72
• 5 結(jié)論72-74
• 第六章 肝素-超氧化物歧化酶結(jié)合物(Hep-SOD)防治輻射損傷體內(nèi)藥效評價74-88
• 1 材料74-75
• 1.1 試劑74
• 1.2 儀器74-75
• 1.3 動物75
• 2 方法75-77
• 2.1 動物分組75
• 2.2 小鼠急性輻射損傷模型75
• 2.3 生化指標(biāo)測定75-76
• 2.3.1 器官指數(shù)75
• 2.3.2 造血功能指標(biāo)75-76
• 2.3.2.1 脾結(jié)節(jié)(CFU-S)計數(shù)75
• 2.3.2.2 骨髓有核細(xì)胞(BWNC)計數(shù)75
• 2.3.2.3 骨髓DNA含量測定75-76
• 2.3.3 外周血象計數(shù)76
• 2.3.4 肝功檢測76
• 2.3.5 組織抗氧化能力檢測76
• 2.3.6 胸腺DNA瓊脂糖凝膠電泳76
• 2.3.6.1 胸腺DNA的提取76
• 2.3.6.2 DNA瓊脂糖凝膠電泳76
• 2.3.7 病理切片觀察76
• 2.4 數(shù)據(jù)處理76-77
• 3 結(jié)果77-84
• 3.1 器官指數(shù)77
• 3.2 造血功能77-78
• 3.3 外周血象計數(shù)78-79
• 3.4 肝功檢測79
• 3.5 組織抗氧化能力檢測79-81
• 3.5.1 MDA檢測79-80
• 3.5.2 GSH檢測80-81
• 3.6 胸腺DNA瓊脂糖凝膠電泳81-82
• 3.7 組織病理切片觀察82-84
• 3.7.1 肝組織病理切片觀察82-83
• 3.7.2 肺組織病理切片觀察83-84
• 3.7.3 小腸組織病理切片觀察84
• 4 討論84-87
• 4.1 Hep-SOD對骨髓抑制的調(diào)控84-85
• 4.2 Hep-SOD對氧化應(yīng)激的調(diào)控85-86
• 4.3 Hep-SOD對肺損傷的保護(hù)作用86-87
• 5 結(jié)論87-88
• 全文總結(jié)88-89
• 參考文獻(xiàn)89-104
• 致謝104-105
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文105-106
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表106

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 黃壽吾,李惜光,楊春雷;肝素抗凝血和抗血栓作用機(jī)理研究的某些進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).輸血及血液學(xué)分冊;1996年02期

2 朱敏恒,吳越;動脈粥樣硬化發(fā)生機(jī)制的若干研究進(jìn)展[J];農(nóng)墾醫(yī)學(xué);2002年03期

3 常雅寧,王志友,劉金秀,楊昭鵬,譚華;兩種連苯三酚自氧化法測定超氧化物歧化酶的比較[J];藥物分析雜志;2001年05期

4 齊敬總;王鳳山;張鴻偉;曹吉超;張?zhí)烀?;低分子肝素修飾超氧化物歧化酶及修飾酶的理化性質(zhì)研究[J];中國藥學(xué)雜志;2006年02期

5 袁勤生;;超氧化物歧化酶的分析測定[J];中國醫(yī)藥工業(yè)雜志;1989年10期

  本文關(guān)鍵詞：肝素—超氧化物歧化酶結(jié)合物（Hep-SOD）防治輻射損傷作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：439605