本文關(guān)鍵詞：HIV-TAT PTD結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的SOD_1轉(zhuǎn)導(dǎo)對放射性皮膚損傷的治療作用及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分：TAT-SOD1原核表達(dá)載體的構(gòu)建及重組蛋白的表達(dá)純化 目的：超氧化物歧化酶SOD由于具有催化超氧陰離子自由基降解為氧氣和過氧化氫的功能，廣泛應(yīng)用于臨床常用的皮膚射線防護(hù)噴劑中。但普通的SOD1蛋白一方面由于來源于動物血液，存在安全性隱患，另一方面由于分子量大，無法跨越細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，限制了其應(yīng)用。本研究擬在大腸桿菌中表達(dá)融合了蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（PTD）HIV-TAT及人銅鋅超氧化物歧化酶（Gu/Zn SOD, SOD1）的重組蛋白（TAT-SOD1），純化上述蛋白后驗(yàn)證其蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)作用及入胞后的生物學(xué)作用。 方法：合成HIV-TAT結(jié)構(gòu)域的編碼序列(YGRKKRRQRRR)及利用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增人SOD1編碼序列后，插入到原核表達(dá)載體pET-28a，由此產(chǎn)生了pET-28a-TAT-SOD1原核表達(dá)載體。我們同時(shí)構(gòu)建了不含TAT結(jié)構(gòu)域的pET-28a-SOD1原核表達(dá)載體。利用宿主大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)重組蛋白，超聲破碎細(xì)胞后，利用鎳-瓊脂糖凝膠層析柱純化后得到了重組TAT-SOD1蛋白。利用免疫熒光試驗(yàn)、SOD酶活試驗(yàn)，超氧陰離子清除試驗(yàn)及總抗氧化能力測定試驗(yàn)驗(yàn)證重組TAT-SOD1蛋白的跨膜作用及跨膜后的生物學(xué)活性。 結(jié)果：成功構(gòu)建了pET-28a-TAT-SOD1原核表達(dá)載體，導(dǎo)入大腸桿菌后，通過誘導(dǎo)表達(dá)純化，得到了高純度重組TAT-SOD1蛋白。免疫熒光結(jié)果顯示重組蛋白能夠跨細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。SOD酶活試驗(yàn)，超氧陰離子清除試驗(yàn)及總抗氧化能力測定試驗(yàn)結(jié)果示，入胞后的重組蛋白仍然保留生物學(xué)活性。 結(jié)論：通過將原核表達(dá)載體pET-28a-TAT-SOD1導(dǎo)入大腸桿菌，表達(dá)及純化得到重組TAT-SOD1蛋白，驗(yàn)證了其跨膜作用及跨膜后的生物學(xué)活性。 第二部分：重組TAT-SOD1蛋白對皮膚細(xì)胞電離輻射損傷防護(hù)作用及機(jī)制研究 目的：研究TAT-SOD1對比普通SOD1對人皮膚HaCaT細(xì)胞輻射損傷的防護(hù)作用及機(jī)制，進(jìn)一步在動物模型上驗(yàn)證TAT-SOD1的輻射保護(hù)作用及其機(jī)制。 方法：CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力的變化；Annexin V-PI雙染及Western Blot檢測凋亡相關(guān)蛋白用于檢測電離輻射所致細(xì)胞凋亡；DCFH2-DA實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞內(nèi)電離輻射誘導(dǎo)的自由基；Mito-Tracker線粒體染色實(shí)驗(yàn)檢測電離輻射所致線粒體損傷；γH2AX免疫熒光檢測DNA雙鏈斷裂（DSB）。建立放射性皮膚損傷的SD大鼠模型丙二醛（MDA）及DCFH2-DA用于檢測SD大鼠電離輻射損傷后皮膚脂質(zhì)過氧化及皮膚組織自由基水平。 結(jié)果：在20Gy X射線照射后，對比PBS組與普通SOD1組，TAT-SOD1組皮膚HaCaT細(xì)胞增殖能力損傷減輕。流式細(xì)胞儀分析TAT-SOD1組HaCaT細(xì)胞凋亡明顯減少；Western Blot表明凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3，Bax表達(dá)明顯減少、抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加，提示重組TAT-SOD1蛋白可以明顯減輕電離輻射所致皮膚細(xì)胞HaCaT的凋亡。TAT-SOD1可以明顯減輕X射線所致細(xì)胞內(nèi)明顯增加的自由基水平和線粒體損傷。5Gy X射線照射后，TAT-SOD1組DNA雙鏈斷裂的數(shù)目明顯減少，，雙鏈斷裂的修復(fù)較PBS及普通SOD1組快。動物實(shí)驗(yàn)表明，45Gy電子線照射后，SD大鼠皮膚組織的脂質(zhì)過氧化及自由基水平均明顯升高，而TAT-SOD1可以明顯抑制電離輻射所致脂質(zhì)過氧化及活性氧水平。 結(jié)論： TAT-SOD1能夠明顯減輕電離輻射所致HaCaT細(xì)胞損傷，并且能夠減少SD大鼠電離輻射照射后皮膚組織的活性氧及脂質(zhì)過氧化水平，為放射性皮膚損傷的救治提供了新的治療策略。
【關(guān)鍵詞】：銅鋅超氧化物歧化酶 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域 HIV-TAT結(jié)構(gòu)域 原核表達(dá) 電離輻射誘導(dǎo)皮膚損傷 細(xì)胞增殖能力 細(xì)胞凋亡 自由基 線粒體損傷 DNA雙鏈斷裂 脂質(zhì)過氧化
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R818
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 引言10-16
• 參考文獻(xiàn)12-16
• 第一部分 TAT-SOD1原核表達(dá)載體的構(gòu)建及重組蛋白的表達(dá)純化16-41
• 前言16-17
• 材料和方法17-31
• 一、 材料與儀器17-19
• 二、 實(shí)驗(yàn)方法19-31
• 結(jié)果31-36
• 一、 pET28a-TAT-SOD1原核表達(dá)載體的鑒定31-33
• 二、 重組載體 pET28a-TAT-SOD1在 E.coli BL21（DE3）中的融合表達(dá)及SDS-PAGE 電泳鑒定33
• 三、 TAT 介導(dǎo)的融合蛋白 TAT-SOD1的入胞效應(yīng)33-34
• 四、 TAT-SOD1跨膜后的生物學(xué)活性檢測34-36
• 討論36-38
• 參考文獻(xiàn)38-41
• 第二部分 重組 TAT-SOD1蛋白對皮膚細(xì)胞電離輻射損傷防護(hù)作用及機(jī)制研究41-68
• 前言41-42
• 材料和方法42-53
• 一、 實(shí)驗(yàn)材料與儀器42-44
• 二、 實(shí)驗(yàn)方法44-53
• 結(jié)果53-62
• 一、 細(xì)胞水平研究 TAT-SOD1對放射性皮膚損傷的防護(hù)作用53-61
• 二、 動物水平研究 TAT-SOD1對放射性皮膚損傷的防護(hù)作用61-62
• 討論62-64
• 參考文獻(xiàn)64-68
• 本文研究結(jié)果及結(jié)論68-69
• 綜述69-88
• 參考文獻(xiàn)78-88
• 縮略詞表88-90
• 攻讀學(xué)位期間本人出版或公開發(fā)表的論著、論文90-91
• 致謝91-92

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本文編號：441273