本文關(guān)鍵詞：耐輻射球菌PprI和TAT-PprI蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)及其抗輻射作用與機(jī)理的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:耐輻射球菌是一種對(duì)電離輻射、紫外線等輻射引起的致死和突變效應(yīng)具有極強(qiáng)抗性的微生物。這類超強(qiáng)的輻射抗性和它自身?yè)碛械耐晟聘咝У腄NA損傷修復(fù)通路密切相關(guān)。PprI是耐輻射球菌中一個(gè)獨(dú)有的功能蛋白,它在DNA損傷修復(fù)的復(fù)雜調(diào)控中起著關(guān)鍵作用,被認(rèn)為是耐輻射球菌DNA損傷修復(fù)通路的靶開關(guān)。耐輻射球菌發(fā)現(xiàn)50余年來(lái),耐輻射球菌PprI蛋白對(duì)原核生物的輻射防治作用及其抗輻射機(jī)制已有較深入的研究。本課題則研究在真核系統(tǒng)中高效表達(dá)和純化PprI和TAT-PprI蛋白的方法,并且探討其在真核細(xì)胞中的抗輻射作用和機(jī)制,為急性放射損傷的臨床防治提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)資料,迄今尚未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外報(bào)道。材料與方法:本實(shí)驗(yàn)以本課題組吳偉碩士構(gòu)建的pHBM905A-His-PprI載體和喬惠萍博士構(gòu)建的pPICZαA-TAT-PprI載體為模板,在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中優(yōu)化表達(dá)和純化條件,旨在獲得大量的耐輻射球菌PprI蛋白和TAT-PprI蛋白。以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)為作用對(duì)象,應(yīng)用免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察PprI和TAT-PprI蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布情況,應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)PprI和TAT-PprI蛋白對(duì)HUVEC毒性和輻射細(xì)胞增殖的影響,應(yīng)用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PprI和TAT-PprI蛋白對(duì)輻射細(xì)胞存活的影響�？寡趸瘜�(shí)驗(yàn)應(yīng)用熒光探針DCFH-DA檢測(cè)PprI和TAT-PprI蛋白對(duì)受照HUVEC ROS水平的影響,同時(shí)應(yīng)用抗氧化試劑盒檢測(cè)PprI和TAT-PprI蛋白對(duì)受照HUVEC超氧化物歧化酶(SOD)活性、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量的影響。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)PprI和TAT-PprI蛋白對(duì)HUVEC凋亡的影響,同時(shí)應(yīng)用免疫印跡檢測(cè)PprI和TAT-PprI蛋白對(duì)線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax)表達(dá)的影響。DNA損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察PprI和TAT-PprI蛋白對(duì)受照HUVECγH2AX焦點(diǎn)數(shù)的影響,同時(shí)應(yīng)用免疫印跡檢測(cè)PprI和TAT-PprI蛋白對(duì)真核生物重組修復(fù)蛋白(Rad51)表達(dá)的影響。結(jié)果:1.成功優(yōu)化了耐輻射球菌PprI和TAT-PprI蛋白的表達(dá)及純化條件,一次培養(yǎng)高效獲得了5 mg耐輻射球菌PprI蛋白和5 mg TAT-PprI蛋白。2.與普通的耐輻射球菌ppri蛋白相比,tat-ppri蛋白具有較強(qiáng)的跨膜能力,進(jìn)入細(xì)胞主要與細(xì)胞器和細(xì)胞核作用。3.細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,耐輻射球菌ppri和tat-ppri蛋白分別在0-10、0-25μg/ml的濃度范圍內(nèi)對(duì)huvec無(wú)毒性作用(p0.05)。ppri蛋白濃度大于20μg/ml時(shí)對(duì)huvec的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用(p0.05),ppri蛋白與huvec作用24、48、72h細(xì)胞的半抑制率ic50值分別為63.58、51.80、32.46μg/ml;tat-ppri蛋白濃度大于50μg/ml時(shí)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用(p0.05),tat-ppri蛋白與huvec作用24、48、72h細(xì)胞的半抑制率ic50值分別為107.90、97.26、87.55μg/ml。4.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ppri和tat-ppri蛋白濃度在0.8-8μg/ml時(shí)對(duì)受照細(xì)胞的增殖有明顯的促進(jìn)作用(p0.05~0.001)。5.輻射細(xì)胞存活曲線顯示,細(xì)胞吸收劑量為2、4、6、8gy時(shí),ppri和tat-ppri蛋白作用組的輻射細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)均高于單純照射組,結(jié)果具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05~0.001);ppri和tat-ppri蛋白作用組的存活曲線參數(shù)d0、dq、n、sf2值也高于單純照射組;并且吸收劑量為4、6和8gy時(shí),tat-ppri蛋白作用組的存活分?jǐn)?shù)顯著高于ppri蛋白作用組(p0.05)。6.抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與單純照射組比較,huvec在照射前給予耐輻射球菌ppri和tat-ppri蛋白均能顯著降低細(xì)胞內(nèi)的ros水平(p0.001)和mda含量(p0.05);照射前加入耐輻射球菌tat-ppri蛋白細(xì)胞內(nèi)sod活性和cat活性均顯著高于單純照射組和ppri蛋白組(p0.05),而照前加入耐輻射球菌ppri蛋白對(duì)增加細(xì)胞內(nèi)sod活性和cat活性無(wú)影響(p0.05)。7.細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與單純照射組相比,照射前給予耐輻射球菌ppri和tat-ppri蛋白均能顯著降低受照細(xì)胞凋亡率(p0.01~0.001);并且照射前給予tat-ppri蛋白增加了bcl-2的表達(dá),同時(shí)降低了bax的表達(dá)(p0.01~0.001),而照射前加入耐輻射球菌ppri蛋白與單純照射組相比bcl-2和bax的表達(dá)量無(wú)顯著差異(p0.05)。8.dna損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與單純照射組相比,照射前給予耐輻射球菌ppri和tat-ppri蛋白均能顯著降低受照細(xì)胞γh2ax焦點(diǎn)數(shù)(p0.05),并且顯著增加rad51蛋白的表達(dá)量(p0.01~0.001)。結(jié)論:1.成功優(yōu)化了含耐輻射球菌pprI基因的畢赤酵母重組pHBM905A-His-PprI/GS115菌株和pPICZαA-TAT-PprI/X33菌株的表達(dá)及純化條件,獲得了大量的耐輻射球菌PprI融合蛋白和TAT-PprI融合蛋白。2.TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域能介導(dǎo)PprI蛋白跨膜進(jìn)入細(xì)胞,廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核。3.細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,耐輻射球菌PprI和TAT-PprI蛋白具有較寬的安全劑量范圍,分別在0-10、0-25μg/mL的濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)抑制作用。4.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,耐輻射球菌PprI和TAT-PprI蛋白安全劑量范圍內(nèi)具有一個(gè)較寬的細(xì)胞增殖濃度范圍(0.8-8μg/mL),在該范圍內(nèi)PprI和TAT-PprI蛋白對(duì)受照HUVEC的增殖有明顯的促進(jìn)作用。5.耐輻射球菌PprI和TAT-PprI蛋白能增加細(xì)胞的平均致死劑量,提高細(xì)胞的放射抗拒性,增強(qiáng)細(xì)胞輻射損傷的修復(fù)能力。并且TAT-PprI蛋白的抗輻射效果更顯著。6.耐輻射球菌PprI和TAT-PprI蛋白顯著降低受照細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平,增強(qiáng)了抗氧化酶的活性,降低了細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。與耐輻射球菌PprI蛋白相比,TAT-PprI蛋白的抗氧化作用更顯著。7.耐輻射球菌PprI和TAT-PprI蛋白顯著降低輻射細(xì)胞的凋亡率。與耐輻射球菌PprI蛋白相比,TAT-PprI蛋白在調(diào)控細(xì)胞凋亡線粒體通道蛋白的表達(dá)方面發(fā)揮更顯著的作用。8.耐輻射球菌PprI和TAT-PprI蛋白顯著降低受照細(xì)胞γH2AX焦點(diǎn)數(shù),促進(jìn)了DNA修復(fù)蛋白R(shí)ad51的表達(dá)。與PprI蛋白相比,TAT-PprI蛋白在DNA損傷修復(fù)方面發(fā)揮的作用更顯著�？傊�,我們?cè)趪?guó)內(nèi)外首次在畢赤酵母中獲得高效表達(dá)和純化的耐輻射球菌PprI和TAT-PprI蛋白,并將該原核蛋白成功用于人離體細(xì)胞急性放射損傷的防治,發(fā)現(xiàn)該蛋白具有顯著地抗輻射損傷作用,該作用與其抗氧化、抗凋亡及增強(qiáng)DNA損傷修復(fù)的機(jī)制密切相關(guān),具有跨膜作用的TAT-PprI蛋白的抗輻射作用顯著優(yōu)于PprI蛋白。
【關(guān)鍵詞】：耐輻射球菌 PprI蛋白 畢赤酵母 輻射抗性 DNA損傷修復(fù)
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R811
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-14
• 前言14-19
• 一、耐輻射球菌Ppr I蛋白的發(fā)現(xiàn)14
• 二、耐輻射球菌Ppr I蛋白的結(jié)構(gòu)14-15
• 三、耐輻射球菌Ppr I蛋白的功能研究15
• 四、耐輻射球菌Ppr I蛋白研究進(jìn)展及本實(shí)驗(yàn)要解決的問(wèn)題15-16
• 參考文獻(xiàn)16-19
• 第一部分 耐輻射球菌Ppr I和TAT-Ppr I蛋白在畢赤酵母菌中的高效表達(dá)及純化19-35
• 材料與方法19-25
• 一、材料19-23
• 二、實(shí)驗(yàn)方法23-25
• 結(jié)果25-31
• 一、耐輻射球菌Ppr I蛋白的表達(dá)純化25-27
• 二、耐輻射球菌TAT-Ppr I蛋白的表達(dá)與純化27-31
• 討論31-33
• 小結(jié)33
• 參考文獻(xiàn)33-35
• 第二部分 耐輻射球菌Ppr I和TAT-Ppr I蛋白在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)分布、毒性及輻射生存作用的研究35-48
• 材料與方法35-38
• 一、材料35-36
• 二、實(shí)驗(yàn)方法36-38
• 結(jié)果38-44
• 一、免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察Ppr I蛋白、TAT-Ppr I蛋白在HUVEC分布38-39
• 二、耐輻射球菌Ppr I蛋白、TAT-Ppr I蛋白的細(xì)胞毒性作用39-42
• 三、耐輻射球菌Ppr I蛋白、TAT-Ppr I蛋白的細(xì)胞增殖作用42-43
• 四、耐輻射球菌Ppr I蛋白、TAT-Ppr I蛋白對(duì)輻射細(xì)胞克隆形成的影響43-44
• 討論44-45
• 小結(jié)45-46
• 參考文獻(xiàn)46-48
• 第三部分 耐輻射球菌Ppr I和TAT-Ppr I蛋白對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞輻射損傷修復(fù)機(jī)制的研究48-74
• 材料與方法48-55
• 一、材料48-51
• 二、實(shí)驗(yàn)方法51-55
• 結(jié)果55-68
• 一、耐輻射球菌Ppr I蛋白、TAT-Ppr I蛋白對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶類的影響55-59
• 二、耐輻射球菌Ppr I蛋白、TAT-Ppr I蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡的影響59-63
• 三、耐輻射球菌Ppr I蛋白、TAT-Ppr I蛋白對(duì)DNA損傷修復(fù)的影響63-68
• 討論68-71
• 小結(jié)71
• 參考文獻(xiàn)71-74
• 結(jié)論74-76
• 綜述 耐輻射球菌輻射抗性和DNA修復(fù)機(jī)制的研究進(jìn)展76-85
• 參考文獻(xiàn)80-85
• 研究生期間發(fā)表論文85-86
• 附錄86-88
• 致謝88-89

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 陳婷婷;連利霞;牟英;楊占山;;抗輻射球菌pprI基因活體電轉(zhuǎn)染救治小鼠γ射線損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J];輻射研究與輻射工藝學(xué)報(bào);2010年03期

2 叢瑛;吳偉;文玲;楊占山;;耐輻射球菌pprI基因轉(zhuǎn)染對(duì)受照酵母菌抗氧化能力的影響[J];輻射研究與輻射工藝學(xué)報(bào);2013年04期

  本文關(guān)鍵詞：耐輻射球菌PprI和TAT-PprI蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)及其抗輻射作用與機(jī)理的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：354660