【摘要】： 背景和目的： 血管新生(angiogenesis)是指在機體生長發(fā)育過程中或創(chuàng)傷修復、缺血缺氧和炎癥等情況下,原有微血管內(nèi)皮細胞(endothelial cell, EC)經(jīng)過生芽、遷移、增殖與基質(zhì)重塑等形成新毛細血管的過程。在組織再生、發(fā)育和創(chuàng)傷修復過程中,血管形成是一個基本的生理過程,如各種創(chuàng)傷、潰瘍、心肌梗塞、慢性感染等愈合過程都需要血管形成的參與,但是在許多病理狀態(tài)下也存在血管生成失調(diào),例如糖尿病視網(wǎng)膜病、動脈硬化和實體腫瘤等嚴重危害人類健康的疾病中。因此,高敏感性、無創(chuàng)性、靶向性、早期定量評價血管新生對于心血管疾病(主要是缺血性心臟病和外周動脈閉塞性疾病)和腫瘤性疾病都具有重要的意義。對于心血管疾病來說,通過顯示新生血管數(shù)量和空間分布來評估微血管對生長因子的早期反應,對指導向缺血局部組織輸送促血管合成蛋白或基因是十分有用的。對于腫瘤性疾病來說,及早顯影新生血管則能早期發(fā)現(xiàn)腫瘤及微小轉(zhuǎn)移灶,有利于病人的早期治療；而動態(tài)性的監(jiān)測新生血管則可以評估抗腫瘤治療的效果。 超聲分子成像是近年來興起的一門無創(chuàng)性分子影像技術,它是通過對普通超聲微泡表面進行特殊處理,將靶向于病變組織特定分子的特異配體連接于普通超聲微泡外殼構建成靶向超聲微泡,后者經(jīng)靜脈注入后靶向性黏附、聚集并較長時間滯留于靶組織中,再通過對比超聲(contrast-enhanced ultrasound, CEU)檢查而產(chǎn)生分子水平的特異的“主動性靶向超聲分子顯像”(active targeted ultrasound molecular imaging)的一門新興的超聲成像技術。近幾年來,運用靶向超聲分子成像技術評價血管新生應已日益成為國內(nèi)外超聲領域的研究熱點,并已經(jīng)實現(xiàn)了從分子水平對腫瘤性和缺血性血管新生的初步評價。Ellegala等構建攜Echistatin的靶向微泡可以有效評價大鼠惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型的新生血管。Leong-Poi等通構建了攜帶抗αv-整合素單抗的靶向超聲微泡,體外實驗發(fā)現(xiàn)該靶向微泡與基質(zhì)膠新生血管的結合率明顯高于正常血管內(nèi)皮細胞。 基質(zhì)膠是一種來源于EHS小鼠腫瘤細胞提取的基底膜的復合物。它在4℃的時候為液態(tài),但在室溫條件下,可自動聚集產(chǎn)生類似于哺乳動物細胞基底膜的生物活性基質(zhì)材料,它具有良好的可操作性和可重復性,是公認的血管新生模型,已被廣泛應用于血管新生的實驗研究。將基質(zhì)膠注入皮下后,內(nèi)皮細胞向基質(zhì)膠中遷移形成新生血管,血管形成過程大約在10天左右完成,當加入適當濃度的促血管生成因子后,可以加快血管的生成。 堿性成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor-2, FGF-2)是體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的最為有效的血管形成因子之一。它對新生血管形成過程中多個環(huán)節(jié)如毛細血管基底膜降解、內(nèi)皮細胞遷移增生、膠原合成、小血管腔形成均有明顯促進作用,并且可以下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。已證實FGF-2在體內(nèi)、外均有明顯的促新生血管形成作用。FGF-2可促進具有基底膜作用的蛋白激酶釋放,從而促進毛細血管基底膜降解,促進小血管的形成。FGF-2能促進αv-整合素的表達,而αv-整合素是良好的血管新生成像靶點。理論上,不同濃度的FGF-2將誘導不同程度的αv-整合素表達。因此,本研究將不同濃度的FGF-2分別加入到基質(zhì)膠中構建不同程度的血管新生模型。 Leong-Poi等使用αv-整合素靶向超聲微泡對基質(zhì)膠模型進行對比超聲研究,靶向超聲微泡的聲強度高于普通微泡(P0.05),但未設立封閉組探討靶向超聲微泡評價血管新生的特異性。Stieger等用非靶向微泡評價基質(zhì)膠模型的血管新生,免疫組化的微血管密度和超聲的增強區(qū)域正相關(r=0.65,P0.05)。雖然,超聲分子成像評價血管新生已經(jīng)取得了初步成功,但目前仍沒有對靶向超聲分子成像評價血管新生的特異性和定量化進行研究的報道。因此,我們通過分別向基質(zhì)膠中加入不同量的FGF-2,建立基質(zhì)膠血管新生模型,并通過單抗封閉新生血管αv-整合素分子靶點的方法建立陰性對照模型,旨在探討攜帶αv-整合素分子探針的超聲分子成像評價不同濃度堿性成纖維細胞生長因子(FGF-2)介導的血管新生,并對血管新生的定量化評價進行初步的研究。 材料和方法 1、超聲微泡的制備：各種脂質(zhì)材料按一定比例75℃水浴溶解于適量蒸餾水中,同時通全氟丙烷(C3F8)氣體,超聲振蕩至形成乳白色液體制備生物素(Biotin)化脂質(zhì)微泡。生物素化脂質(zhì)微泡經(jīng)靜置棄下清液并加入等量蒸餾水去除未結合脂質(zhì)純化4次后,按一定比例加入抗生蛋白鏈菌素／親和素(streptavidin)。繼續(xù)靜置棄下清液并加入等量蒸餾水去除未結合抗生蛋白鏈菌素純化微泡2次后得到外殼結合有抗生蛋白鏈菌素的脂質(zhì)微泡,再按一定比例加入生物素化鼠抗人αv-整合素單抗(Biotin conjugated mouse Anti-humun avMonoclone Antibody)得到攜帶抗αv-整合素單抗靶向微泡(MBα),最后靜置棄下清液并加入等量蒸餾水去除未結合抗體,純化攜帶抗αv-整合素單抗靶向微泡(MBα)2次。用上述方法構建攜同型抗體微泡作為對照微泡(MBc)。MBα和MBc均于冰箱中4℃保存?zhèn)溆�。采用庫爾特計�?shù)儀測量MBα及MBc的平均粒徑及濃度。 2、MBα的體外鑒定：采用綠色熒光標記的二抗與抗αv-整合素單抗結合,熒光顯微鏡下觀察抗αv-整合素單抗與微泡的連接情況。采用平行板流動腔技術在體外模擬的生理血流條件下評價MBα與αv-整合素Fc段(Recombinant humanαv-integrin/Fc Chimera,αvSFc)的靶向黏附效能。 3、基質(zhì)膠模型的制備：在昆明小鼠皮下注射基質(zhì)膠以促進血管新生,分別向基質(zhì)膠中添加不同量的FGF-2 (sigma公司),配成濃度為1μg/mL和0.5μg/mL的兩種基質(zhì)膠,并加入肝素(64U/mL)。將20只小鼠隨機分為2組,分別注射兩種濃度的基質(zhì)膠。20只昆明小鼠經(jīng)常規(guī)麻醉后,在左側(cè)腹部皮下注射0.6ml基質(zhì)膠,在基質(zhì)膠注射部位形成橢圓形隆起。 4、CEU檢查：在注射基質(zhì)膠10天后,將小鼠麻醉后進行對比超聲檢查。將自制水囊放在小鼠的左側(cè)腹部,用自制支架固定超聲探頭(17L5)于水囊上。調(diào)整探頭位置獲得良好圖像后保持探頭位置在整個實驗過程中不變,儀器的各項參數(shù)在整個實驗過程中保持不變。CEU采用經(jīng)尾靜脈微泡彈丸式注射法進行,超聲造影采用經(jīng)尾靜脈隨機(間隔30min)先后注射MBα和MBC(約為5×106個)。經(jīng)過6min循環(huán)時間待血池中循環(huán)微泡消失后對實驗小鼠進行注射基質(zhì)膠的部位進行CEU檢查,獲取顯影圖像。CEU檢查采用二次諧波成像(second harmonic imaging)技術進行,探頭發(fā)射和接收頻率分別為7 MHz和14MHz,機械指數(shù)(Mechanical Index, MI)為0.18,超聲發(fā)射間隔(Pulsing Interval, PI)時間設定為10s,獲取第一幀CEU圖像后給予高MI(1.9)連續(xù)超聲發(fā)射2-3s以破壞微泡,繼續(xù)存儲本底圖像4-5幀,全部聲學造影圖像存于CD盤,以備脫機分析。采用MCE軟件分析CEU圖像,測量實驗小鼠注射基質(zhì)膠的部位顯影的聲強度(video intensity, VI)數(shù)值并制作彩色編碼圖。采用紅色、橙色和白色分別代表基質(zhì)膠顯影程度由強到弱。 5、病理學檢查和免疫組化檢查：完成CEU圖像采集后,取出實驗小鼠基質(zhì)膠,10%甲醛固定,行病理學和免疫熒光檢查。 6、平均熒光強度(median fluorescence:intensity, MFI)測定和血管計數(shù)(micro vessel count, MVC):在熒光照片選取相同面積的50個區(qū)域,使用Imagepro plus6.0軟件分析平均熒光強度。 ①得到灰度圖片； ②黑白反相； ③光密度校正； ④在count/size中選擇強度閡值10-200,過濾掉明亮的雜質(zhì)熒光點； ⑤選擇面積area與積分光密度(IOD)過濾值30像素； ⑥IOD/area得到該區(qū)域像素的平均灰度,即代表平均熒光強度,然后計算這50個區(qū)域的平均值。 單位面積血管計數(shù)：在上述50個區(qū)域,以有管腔結構為準,進行血管計數(shù),計算單位面積血管計數(shù)。 結果 1、微泡制備情況：采用庫爾特計數(shù)儀測得MBc粒徑為2.12±1.13μm,濃度約為2.80～4.56×108個／ml；MBα粒徑2.08±0.65μm,濃度約為3.07～4.75×108個／ml。 2、MBα體外鑒定結果：采用綠色熒光標記的二抗與抗αv-整合素單抗結合,熒光顯微鏡下觀察顯示MBa外殼顯明顯綠色熒光,表明抗αv-整合素單抗與微泡外殼連接效果良好。平行板流動腔體外評價結果顯示,在模擬微血管生理血流條件的剪切應力(1.0dyn／cm2)下MBα可與包被于平行板流動腔的αvSFc有效結合,顯示了很好的主動性靶向黏附效能。 3、超聲造影檢查：MBα注射后基質(zhì)膠外周帶及周圍組織均可見明顯的超聲顯影,而基質(zhì)膠中心部位未見超聲顯影,6min后周圍組織未見顯影,而基質(zhì)膠外周帶仍可見明顯的超聲顯影,MBc注射后顯影情況與MBa基本相同,但6min后基質(zhì)膠未見明顯的超聲顯影。預先用αv-整合素抗體封閉后,MBα及MBc注射后基質(zhì)膠也可呈明顯的超聲顯影,但6min后MBα和MBc均未見明顯的超聲顯影。 4、圖像分析結果：在高濃度組中,封閉前基質(zhì)膠模型中MBa組呈明顯的超聲顯影,而MBc組僅見輕度的超聲顯影,兩者之間有明顯差異(P0.05)。預先單抗封閉αv-整合素后,MBa和封閉前的MBα之間有明顯差異(P0.05)；而MBc的Ⅵ值較封閉前無明顯變化,兩者之間無明顯差異(P0.05)。低劑量組同樣出現(xiàn)上述結果。 5、基質(zhì)膠病理及免疫熒光結果：HE染色切片顯示,小鼠基質(zhì)膠外周帶可見豐富的新生血管,血管中可見紅細胞的存在；高濃度FGF-2組基質(zhì)膠中新生血管多于低濃度FGF-2組；高濃度組血管密度高,而且更靠近中央?yún)^(qū)。免疫熒光顯示基質(zhì)膠新生血管內(nèi)皮細胞有大量的αv-整合素,高濃度FGF-2組基質(zhì)膠內(nèi)皮細胞中表達的αv-整合素多于低濃度FGF-2組,封閉后內(nèi)皮細胞中幾乎不表達αv-整合素。 6.在超聲造影中,高濃度組封閉前MBα造影Ⅵ值是低濃度組封閉前的1.4倍；高濃度組封閉后MBα造影Ⅵ值是低濃度組封閉前的1.37倍。在免疫熒光強度測定中,高濃度組封閉前單位面積免疫熒光強度是低濃度組封閉前的1.32倍；高濃度組封閉后是低濃度封閉后的1.33倍。在單位面積血管計數(shù)中,高濃度組封閉前是封閉后的1.2倍；高濃度組封閉前MBα造影Ⅵ值是低濃度組封閉前的1.16倍。 結論： 1、采用“抗生物素蛋白／生物素復合體”可實現(xiàn)抗αv整合素單抗與脂質(zhì)微泡外殼的有效連接而成功構建攜帶抗αv-整合素單抗靶向微泡； 2、應用攜帶αv-整合素分子探針的超聲分子成像可有效特異地評價基質(zhì)膠血管新生,實現(xiàn)對新生血管的早期評價和診斷； 3、αv-整合素可以作為新生血管分子成像的靶點,使用基質(zhì)膠模型評價血管新生的研究具有良好的特異性,可用于定量化研究。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R445.1
【圖文】：

采川綠色熒光標一記的_二抗與抗以v整合索單抗結合，熒光{l己微鏡下觀察{l適示MB‘，，.1}則{!及綠色熒光，表明‘1二物索化抗。v一整合索單抗.習一通過抗/}:.物素蛋自(抗‘卜蛋自鏈菌索)’、‘豐幾物素化脂質(zhì)微泡有效連接(圖l，圖2)。咚11:1別A及圖B分別{，退習功!}入綠色熒光標記MB、在熒光顯微鏡卜照少{二和}司視野顯-.-抗微鏡‘常光卜一照少200一)。

量組對比超聲圖像基質(zhì)膠的vl值，與MBC相比較，*P<0.05;與封比較，洲尸<0.05。度FGF一2刺激組:對比超聲檢查聲強度(VideoIntensit丫Vl)(x士強度單位:VideoIntensityunit，u)因素封閉前封閉后SllmBa14.60士2.723.50士1.0710.56士5.86189.BC4.34士1.023.67士1.214.37士1.270.0um11.21士8.304.00士0.9810.26士7.86187.9F387.630.6216908*

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