【摘要】： 背景和目的： 血栓形成或血栓栓塞是導(dǎo)致心、腦和外周血管事件的最后關(guān)鍵環(huán)節(jié),是致死和致殘的直接原因。以心肌梗死、腦卒中為代表的血栓栓塞性疾病導(dǎo)致的死亡已占到全球總死亡人數(shù)的一半以上,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過腫瘤、傳染性疾病、呼吸系統(tǒng)疾病等造成的死亡,其中很大一部分原因是由于血栓不能早期檢出而延誤治療。超聲是一種被廣泛應(yīng)用于臨床的影像檢測手段,對四肢動、靜脈血栓的診斷與隨訪觀察具有重要的臨床意義,但由于早期血栓的回聲與血液的回聲基本相似,并且對于超聲醫(yī)師的經(jīng)驗水平要求較高,因此,超聲對早期血栓的檢出率及準(zhǔn)確性受到明顯限制,則有賴于有創(chuàng)的動、靜脈造影或昂貴的CT、MRI檢測。因此,如果能夠發(fā)展一種技術(shù)檢測手段,能夠早期無創(chuàng)、敏感而特異性的診斷血栓進(jìn)而早期治療血栓,這對于降低患者的死亡率及并發(fā)癥的發(fā)生率具有非常重要的臨床價值。 近年來,隨著靶向超聲微泡造影劑的出現(xiàn),靶向超聲分子顯像(targeted ultrasound molecular imaging)逐漸成為現(xiàn)實,極大的拓展了傳統(tǒng)超聲微泡的應(yīng)用范圍,使應(yīng)用超聲技術(shù)從分子水平對各種疾病進(jìn)行早期診斷成為可能,被譽為超聲醫(yī)學(xué)發(fā)展史上的“第三次革命”。目前,國際上已經(jīng)有一些實驗室應(yīng)用靶向超聲分子顯像技術(shù)成功對動物深靜脈、心房血栓等進(jìn)行了評價,然而由于動脈血流的高剪切應(yīng)力,實現(xiàn)動脈血栓的靶向超聲分子顯像、需要制備出靶向結(jié)合能力更強的微泡,而國內(nèi)應(yīng)用高效價靶向微泡評價動脈血栓形成的報道幾乎空白,相關(guān)研究基本還沒有實質(zhì)性進(jìn)展。 血栓形成部分原因有賴于血小板的活化、聚集,活化的血小板表面高表達(dá)血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受體,其與纖維蛋白原等物質(zhì)中的精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(RGD)結(jié)合位點結(jié)合,促進(jìn)血小板的聚集和早期血栓的形成。如果在微泡表面裝配上能高效能的主動趨向血小板GPⅡb/Ⅲa受體的配體,那么微泡將可以通過配體-受體的作用結(jié)合在一起,這樣微泡就與血栓中的活化血小板特異性牢固結(jié)合從而實現(xiàn)血栓的早期靶向分子成像。以往研究中將含RGD序列的線性寡肽連接在普通微泡外殼構(gòu)建靶向血栓微泡,結(jié)合對比超聲成功應(yīng)用于深靜脈、心房血栓的靶向成像,研究發(fā)現(xiàn)人工合成的RGD環(huán)寡肽序列能夠模擬體內(nèi)的天然RGD結(jié)合位點,比含RGD序列的線性寡肽具有更強的結(jié)合血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受體的能力,因此,如果將人工合成的RGD環(huán)寡肽序列裝配在普通微泡表面,則具有更強的靶向結(jié)合血栓能力,將有望實現(xiàn)動脈血栓的早期靶向超聲分子顯像。 因此,本研究在普通脂質(zhì)微泡的基礎(chǔ)上,在其外殼通過共價連接的方式連接上能夠和活化血小板高表達(dá)的GPⅡb/Ⅲa受體特異、高效結(jié)合的RGD(Arg-Gly-Asp)環(huán)寡肽序列從而制備血栓靶向超聲微泡(MBRGD),應(yīng)用平行板流動腔評價其與糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受體的親和力及黏附能力,并在體外瓊脂糖流動腔模型及體內(nèi)大鼠腹主動脈血栓模型上,應(yīng)用MBRGD和對比超聲(CEU)檢查相結(jié)合,分別對體外制備的血栓以及大鼠腹主動脈血栓進(jìn)行靶向超聲顯像,目的在于探討MBRGD結(jié)合CEU評價動脈血栓形成的可行性。 材料和方法： 1.超聲微泡的制備及理化性質(zhì)鑒定 各種相關(guān)脂質(zhì)材料與人工合成的磷脂環(huán)五肽或與其分子量相當(dāng)、結(jié)構(gòu)相似的同型非特異性多肽按一定質(zhì)量比例75℃水浴溶解于適量蒸餾水中,同時通全氟丙烷(C3F8)氣體,超聲振蕩至形成乳白色液體制備靶向超聲脂質(zhì)微泡(MBRGD)和同型對照非靶向微泡(MBCON),MBRGD及MBCON經(jīng)靜置棄下清液并加入等量蒸餾水去除未結(jié)合脂質(zhì)純化2次。制備及純化后的MBRGD、MBCON均于冰箱中4℃保存?zhèn)溆�。采用庫爾特計�?shù)儀檢測微泡的粒徑分布及濃度。 2、平行板流動腔體外評價MBRGD與血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)的靶向黏附效能 2.1、結(jié)合實驗：MBRGD和MBCON (5×106/ml)各分成3組(每組n=3),經(jīng)微量注射泵分別以0.6dyn/cm2、1.8 dyn/cm2和3.6dyn/cm2的剪切應(yīng)力通過血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa包被(1000ng/ml)的平行板流動腔；自顯微鏡下觀察到有微泡出現(xiàn)后開始連續(xù)錄像6min,觀察第6分鐘后微泡的結(jié)合情況；各組分別以“糖蛋白GPⅡb/Ⅲa包被(1000ng/ml)+大量RGDfvV (Blocker組,n=3)”和"0ng/ml糖蛋白GPⅡb/Ⅲa包被(空白組,n=3)”為對照。 2.2、解離實驗：平行板流動腔以(1000ng/ml)糖蛋白GPⅡb/Ⅲa包被,流動腔內(nèi)注入5×106/ml或MBCON約0.2ml后靜置5分鐘,先以0.9%生理鹽水(極低剪切應(yīng)力0.2dyn/cm2條件下)沖洗掉靜止但未結(jié)合的微泡,待鏡下無游離的微泡后,每30s逐漸增加剪切應(yīng)力,直至微泡完全解離。20倍物鏡在固定的視野下全程錄像、拍照。 3.應(yīng)用瓊脂糖流動腔模型體外評價MBRGD靶向血栓效能 自制瓊脂糖流動腔模型,將制備的MBRGD和同型對照微泡(MBCON)隨機注入自制瓊脂糖流動腔模型內(nèi),與體外制備的新鮮血栓孵育30 min后,PBS液15 cm/s流速不間斷沖洗血栓,分別在沖洗血栓2、4、6、8、10 min時行對比超聲檢查并測量血栓聲強度(Ⅵ)值。 4.大鼠動脈血栓形成模型的制備及分組 8只實驗大鼠常規(guī)麻醉后,將大鼠仰臥位固定四肢于鼠板上,頸靜脈插管用于注射微泡。經(jīng)腹部正中線位置開口,鈍性分離皮下肌肉,暴露腹主動脈、右側(cè)髂總動脈和下腔靜脈,用棉簽輕輕將腹主動脈和下腔靜脈下端分離。用動脈夾暫時夾閉腹主動脈,將右側(cè)髂總動脈遠(yuǎn)端用細(xì)線結(jié)扎,在其近端血管下穿一根細(xì)線,然后在結(jié)扎部位近端行動脈插管,緊接著將事先置放于聚乙烯管中的細(xì)棉線(該棉線已浸泡過凝血酶)通過鋼絲推送入腹主動脈部位,拔出鋼絲和聚乙烯管,將右側(cè)髂總動脈結(jié)扎,遂松開腹主動脈處的動脈夾開放腹主動脈血流,一小時后可在棉線表面形成不完全阻斷血流血栓。二維超聲可見血栓內(nèi)部的棉線影確定血栓形成的位置。8只制備腹主動脈血栓模型的大鼠先后隨機注入MBRGD和MBCON后行CEU檢查,并根據(jù)注入超聲微泡的不同分為MBRGD組和MBCON組。 5.大鼠腹主動脈CEU檢查及圖像分析：動物模型制備后,用支架固定超聲探頭(17L5)于大鼠腹主動脈棉線置入部位上方,調(diào)整探頭位獲得良好的腹主動脈長軸切面后保持探頭位置在整個實驗過程中不變,儀器的各項參數(shù)在整個實驗過程中不變。CEU檢查采用二次諧波成像(second harmonic imaging)技術(shù)進(jìn)行,探頭發(fā)射和接收頻率分別為7.0 MHz和14MHz,機械指數(shù)(Mechanical Index,MI)為0.18,超聲發(fā)射間隔(Pulsing Interval, PI)時間設(shè)定為10s,靶向超聲成像：每只大鼠采用微量進(jìn)樣器經(jīng)頸靜脈隨機(間隔30min)先后注射MBCON和MBRGD的數(shù)量約為10×106個。在注入微泡10min后行CEU,獲取第一幀圖像后給予高M(jìn)I的連續(xù)超聲發(fā)射2-3s以破壞微泡,繼續(xù)存儲本底圖像2-3幀,全部聲學(xué)造影圖像存于CD盤,以備脫機分析。第一幀圖像聲強度(Ⅵ,視頻密度)可代表靶向微泡在腹主動脈的總濃度,包括粘附血栓濃度和循環(huán)微泡。微泡破壞后存儲圖像上的Ⅵ反應(yīng)的是在血池中循環(huán)微泡的濃度。前者減去后者得到的是粘附血栓的微泡濃度。取圖結(jié)束后,應(yīng)用CEU圖像分析軟件對圖像進(jìn)行分析,測量大鼠腹主動脈血栓造影的Ⅵ值,并用彩色編碼技術(shù)制作動脈血栓顯影的彩色編碼圖像,采用紅色、橙色和藍(lán)色依次代表血栓顯影的強度由強到弱。 6.病理學(xué)檢查：圖像采集完成后,取出大鼠腹主動脈迅速做冷凍切片,行病理學(xué)檢查及免疫組化檢查。 結(jié)果： 1、超聲微泡制備情況：采用聲振法制備的MBRGD-MBCON在顯微鏡下觀察均為透亮微氣泡,大小形態(tài)一致,采用庫爾特計數(shù)儀測得MBRGD平均粒徑2.13±1.18gm,濃度約為3.18-5.26×108個/ml;MBCON平均粒徑2.18±1.11μm,濃度約為3.02-5.18×108個/ml。 2、平行板流動腔法評價MBRGD的制備效果 2.1、平行板流動腔結(jié)合實驗顯示在一定剪切應(yīng)力作用下(0.6-3.6 dyn/cm2) MBRGD與血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa包被的平行板流動腔具有很好的靶向粘附效能,而封閉組和空白對照組中MBRGD幾乎不能與與血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa包被的平行板流動腔結(jié)合,而MBCON不論在Blocker組、空白對照組還是GPⅡb/Ⅲa包被組均不能與平行板流動腔結(jié)合。 2.2、隨著剪切應(yīng)力的不斷增加,可見MBRGD能夠抵抗一定血流剪切應(yīng)力的沖刷,MBRGD半數(shù)解離時剪切應(yīng)力已達(dá)到(25.54±1.27)dyn/cm2,且微泡完全解離時剪切應(yīng)力已高達(dá)(95.63±1.78)dyn/cm2,而MBCON半數(shù)解離時及完全解離時剪切應(yīng)力僅有(4.46±0.09 dyn/cm2,P0.05 vs MBRGD)和(27.29±0.74 dyn/cm2,P0.05 vs MBRGD). 3.體外瓊脂糖流動腔中血栓CEU顯影圖像及Ⅵ分析第一幀CEU圖像(A1)顯示血栓與MBRGD孵育后經(jīng)PBS液沖洗2min后可見顯著的超聲顯影,而與MBCON孵育后經(jīng)PBS液沖洗2mmin后僅見輕度的超聲顯影(A2),其顯影強度較前者明顯減弱。并且,MBRGD組在經(jīng)PBS液沖洗4、6、8、10 min后的血栓超聲顯影均明顯較對照MBCON組強。未經(jīng)PBS沖洗前時兩組微泡之間聲強度值比較無差異(t=-0.119,P=0.907),2、4、6、8、10min時血栓聲強度值MBRGD組均高于MBCON組(t2min=13.488,t4min=8.234,t6min=7.880,t8min=10.079, t10min=10.842,所有P=0.000)；不同時間水平比較有顯著差異(F=136.244,P=0.000),主要表現(xiàn)為Ⅵ值隨沖洗時間呈下降趨勢,MBCON下降幅度較MBRGD大。 4.腹主動脈血栓CEU檢查結(jié)果及Ⅵ分析 MBRGD組的第一幀CEU圖像顯示MBRGD明顯增強腹主動脈血栓的顯影,顯影增強主要在血栓的近端較為顯著；而MBCON組顯示MBCON不能使增強血栓顯影。對比超聲Ⅵ分析：血栓Ⅵ值在MBRGD組和MBCON組分別為18.84±3.06和5.99±1.18,MBRGD組缺血栓Ⅵ值約為MBcON組的3.15倍,兩者之間有顯著性差異(P0.05)。 5.病理學(xué)檢查：將一部分腹主動脈解剖開,肉眼可見在棉線置入處形成動脈血栓,HE及免疫組化結(jié)果顯示：血栓結(jié)構(gòu)中可見大量血小板小梁形成、并且血栓大量表達(dá)GPⅡb/Ⅲa受體,證實為腹主動脈富含血小板血栓形成。 結(jié)論： 1.平行板流行腔實驗證實采用共價連接的方法可成功構(gòu)建攜帶環(huán)寡肽RGD序列的血栓靶向超聲微泡(MBRGD),并且靶向微泡具有較強的主動結(jié)合靶分子及抵抗較高剪切應(yīng)力沖刷的能力。 2.體外瓊脂糖流動腔實驗表明MBRGD具有較好的靶向結(jié)合血栓效能,靶向血栓黏附后能抵抗一定的剪切應(yīng)力,具有較好的靶向血栓分子顯像的效果。體外模擬體內(nèi)剪切應(yīng)力血流環(huán)境評價MBRGD的靶向血栓分子成像效果將有助于預(yù)測MBRGD應(yīng)用于體內(nèi)血栓超聲分子成像的效果。 3.應(yīng)用攜RGD環(huán)寡肽序列的靶向超聲微泡行大鼠腹主動脈血栓對比超聲檢查產(chǎn)生的“主動性靶向超聲分子成像”可有效評價大鼠腹主動脈血栓形成,將有助于血栓形成的早期診斷、靶向帶藥溶栓治療及療效的監(jiān)測等。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R445.1
【圖文】：

(2)體外瓊脂糖流動腔模型制備制備500ml濃度為3%的瓊脂糖溶液，冷卻凝固形成一個具有中空管道的瓊脂糖塊模型(如圖2所示)。然后在中空管道兩端接上銜接裝置，入口端接上盛滿PBs緩沖液的容器，Clampl為入口端的閥(可打開、調(diào)整及關(guān)閉水流，供沖洗血栓)，出口端接上流出裝置，以便廢液流出。clamPZ(關(guān)閉出口管可以確保管道中充滿PBS緩沖液以便超聲成像)。將體外制備好的富含血小板的血栓用一根細(xì)棉線固定于盛滿PBS液的瓊脂模型中空管道中。固定表面涂滿藕合劑的超聲探頭 (17L5)于瓊脂糖塊中空管道側(cè)面。圖2瓊脂糖流動腔模型(3)血栓的二維及cEU成像

結(jié)果結(jié)果微泡制備情況:用聲振法制備的MBRGD、MBcoN在顯微鏡下觀察均為透亮微氣泡，大，采用庫爾特計數(shù)儀測得MBRGD平均粒徑2.30士1.06娜，濃度.26xlo8個/ml;MBeoN平均粒徑2.07士1.13娜，濃度約為3.02一s一(見圖5，圖6)

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 吳爵非;查道剛;楊莉;賓建平;王月剛;劉伊麗;李軍華;勞翼;陳少敏;;平行板流動腔法評價生物素化脂質(zhì)微泡制備效果[J];臨床超聲醫(yī)學(xué)雜志;2008年05期

2 吳爵非;楊莉;賓建平;查道剛;陳少敏;劉伊麗;;在生理血流條件下靶向超聲微泡對P-選擇素的靶向黏附效能[J];中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù);2008年07期

3 鄭道文;楊莉;賓建平;陳楚弟;陳少敏;王月剛;吳平生;;親和素橋連構(gòu)建攜抗P-選擇素單抗靶向超聲微泡及體外熒光鑒定[J];中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù);2008年08期

本文編號：2732792