【摘要】：第一部分載基因陽離子超聲微泡的制備及其特性研究 目的制備一種新型的陽離子脂質(zhì)超聲微泡造影劑，評價其載基因能力、理化特性及兔肝體內(nèi)增強顯像效果。 方法采用薄膜分散、機械震蕩法，經(jīng)PEG修飾，脂膜材料中加入DC-膽固醇，制備陽離子超聲微泡；觀察其形態(tài)、粒徑、表面電位等物理特性，并考察平均粒徑、濃度及表面電位在一定條件下隨時間(6h、12h、24h、2d、7d、14d)變化情況；Nanodrop2000光度儀測定游離DNA量，分析微泡載基因能力；瓊脂糖凝膠電泳檢測微泡與DNA復(fù)合物能否抵抗核酸酶降解；評價兔肝內(nèi)顯影效果及對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）的毒性作用；并與普通脂質(zhì)微泡作對比。 結(jié)果所制備的陽離子微泡形態(tài)規(guī)則，穩(wěn)定性好，馬爾文電位儀測得平均表面電位為(29.02±1.30) mV，2周內(nèi)不同時間點電位變化無統(tǒng)計學差異；2周內(nèi)平均粒徑變化范圍為(1201.4±0.47)～（1405.3±0.25nm），濃度變化范圍為(4.13±0.13)～(3.85±0.05)108/ml。載基因量優(yōu)化結(jié)果顯示最大基因結(jié)合效率為39.7％，最大基因結(jié)合量為4g/108個微泡（microbubble，MB）。薄膜分散制備方法簡單、可靠，且所制陽離子微泡對細胞毒性作用小，與DNA結(jié)合后能抗核酸酶降解，兔肝臟內(nèi)增強顯影持續(xù)時間超過15min。 結(jié)論自制的新型陽離子微泡是一種理想的超聲造影劑，能顯著增加基因攜帶量并保護核酸免遭降解，可望提高UMMD增強轉(zhuǎn)染效率，成為基因投遞系統(tǒng)的優(yōu)化材料。 第二部分超聲聯(lián)合陽離子超聲微泡體外增強基因轉(zhuǎn)染的實驗研究 目的探索超聲破壞陽離子微泡增強基因轉(zhuǎn)染的最佳聲學條件，探討其體外增強基因轉(zhuǎn)染HUVEC效果，與普通脂質(zhì)微泡及脂質(zhì)體2000作比較，評價其增強轉(zhuǎn)染同時對細胞活性影響。 方法根據(jù)細胞存活情況篩選出最佳超聲強度和微泡濃度組合；將陽離子微泡、普通脂質(zhì)微泡、脂質(zhì)體2000及質(zhì)粒DNA以不同的處理組加入培養(yǎng)的HUVEC，分為6組：①單純質(zhì)粒組；②質(zhì)粒＋超聲輻照組；③質(zhì)粒＋陽離子微泡組；④質(zhì)粒＋普通脂質(zhì)微泡＋超聲輻照組；⑤質(zhì)粒＋脂質(zhì)體組；⑥質(zhì)粒＋陽離子微泡＋超聲輻照組；比較各組轉(zhuǎn)染率。同時探討（質(zhì)粒＋陽離子微泡＋超聲輻照）組在不同微泡濃度下HUVEC轉(zhuǎn)染率與存活率關(guān)系，得出有效轉(zhuǎn)染的微泡濃度；增加HEK293細胞在④⑤⑥三組中與HUVEC轉(zhuǎn)染率比較。應(yīng)用CKX41熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(EGFP)表達，F(xiàn)ACS流式儀檢測基因轉(zhuǎn)染率，MTT法分析細胞存活率。 結(jié)果聲能為0.5W/cm2，微泡濃度為3108/ml時，細胞存活率輕度降低，超聲聯(lián)合陽離子微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染HUVEC效果明顯，較普通脂質(zhì)微泡顯著增強，與脂質(zhì)體2000相比未見明顯優(yōu)勢。各處理組對細胞存活率影響無統(tǒng)計學意義，單獨考察（質(zhì)粒＋陽離子微泡＋超聲輻照）組，微泡濃度在(2.5～5.0)×108/ml之間時，有較好轉(zhuǎn)染率且細胞損傷程度低，能實現(xiàn)有效的基因轉(zhuǎn)染；HEK293細胞UMMD介導(dǎo)的陽離子微泡轉(zhuǎn)染率高于脂質(zhì)體2000。 結(jié)論超聲聯(lián)合陽離子微泡在體外證實能夠?qū)崿F(xiàn)HUVEC較高效率的基因轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染率較普通脂質(zhì)微泡介導(dǎo)的明顯提高，尋找最優(yōu)化的聲學條件，在實現(xiàn)高基因轉(zhuǎn)染率時，應(yīng)防止細胞過多死亡。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R445.1
【圖文】：

圖 1.1a 普通脂質(zhì)微泡平均表面電位分布，平均電位約－8.07±0.32 mVFig1.1a Mean surface potential of commonmicrobubble after radiation:－8.07±0.32 mV圖 1.1b 陽離子超聲微泡平均表面電位分布，平均電位約＋29.02±1.30 mVFig1.1b Mean surface potential of cationicmicrobubble after radiation:＋29.02±1.30 mV圖 1.2a 陽離子微泡結(jié)合 DNA 后與核酸酶作用電泳圖Fig1.2a Agarose gel electrophoresis of cationic microbubble carrying plasmid with DNAseI

圖 1.1a 普通脂質(zhì)微泡平均表面電位分布，平均電位約－8.07±0.32 mVFig1.1a Mean surface potential of commonmicrobubble after radiation:－8.07±0.32 mV圖 1.1b 陽離子超聲微泡平均表面電位分布，平均電位約＋29.02±1.30 mVFig1.1b Mean surface potential of cationicmicrobubble after radiation:＋29.02±1.30 mV圖 1.2a 陽離子微泡結(jié)合 DNA 后與核酸酶作用電泳圖Fig1.2a Agarose gel electrophoresis of cationic microbubble carrying plasmid with DNAseI

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 景香香;超聲造影劑靶向性作用機制的研究進展[J];臨床超聲醫(yī)學雜志;2003年06期

2 凌智瑜,王志剛,冉海濤,宮琳,黃晶,羅子國;超聲微泡造影劑對心肌組織毛細血管通透性的影響實驗研究[J];中國超聲醫(yī)學雜志;2004年05期

3 劉亞敏;孫江川;王志剛;常淑芳;李興升;;超聲破壞載紫杉醇微泡對卵巢癌細胞株SKOV3的抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡作用[J];中國超聲醫(yī)學雜志;2007年05期

本文編號：2731390