【摘要】： 第一篇MR功能成像對(duì)大鼠肝纖維化早期診斷、定量分析的實(shí)驗(yàn)研究 肝臟彌漫性病變中,肝纖維化和早期肝硬化因形態(tài)學(xué)改變不明顯而成為影像學(xué)早期診斷面臨的難題,傳統(tǒng)的以反映解剖結(jié)構(gòu)的影像學(xué)方法對(duì)此類(lèi)病變難于提供有價(jià)值的診斷信息。目前,臨床上應(yīng)用的非創(chuàng)性的肝纖維化診斷方法敏感性和特異性較差;肝組織活檢被認(rèn)為是診斷肝纖維化的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但作為一種侵入性的診斷方法,其臨床應(yīng)用具有許多限度。肝纖維化的早期檢測(cè)、早期干預(yù)有助于阻止病變的進(jìn)一步發(fā)展。因此,迫切需要開(kāi)發(fā)無(wú)創(chuàng)性、對(duì)慢性肝病出現(xiàn)肝纖維化能進(jìn)行早期預(yù)測(cè)、病變程度評(píng)價(jià)的新的方法。 本研究通過(guò)CCI4誘導(dǎo)建立大鼠肝纖維化模型,采用磁共振功能成像(彌散加權(quán)成像、波譜成像、灌注成像和肝細(xì)胞特異性對(duì)比劑應(yīng)用)技術(shù),并與病理組織學(xué)對(duì)照,對(duì)肝纖維化進(jìn)展過(guò)程中,分子彌散、能量代謝、血流灌注和肝細(xì)胞功能等多因素病理生理改變進(jìn)行動(dòng)態(tài)、系統(tǒng)研究,國(guó)內(nèi)外類(lèi)似研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究目的在于探討肝纖維化的MR功能成像參數(shù)及最佳成像序列;分析不同程度、不同分期肝纖維化的MR功能成像表現(xiàn),探索肝纖維化MR功能成像的量化診斷指標(biāo);評(píng)價(jià)MR功能成像在肝纖維化、早期肝硬化診斷中的價(jià)值。 第一部分大鼠肝纖維化模型的建立 1.目的:采用SD大鼠皮下注射四氯化碳法,建立肝纖維化動(dòng)物模型,為肝纖維化的MR功能成像和骨髓基質(zhì)細(xì)胞肝移植MR示蹤研究提供不同分期的肝纖維化動(dòng)物模型。 2.方法: 實(shí)驗(yàn)組大鼠腹部皮下注射40%CCl4油溶液,劑量為3ml/kg體重,2次/周,首次劑量為5ml/kg體重;10%乙醇溶液作為唯一飲用水。對(duì)照組大鼠腹部皮下注射生理鹽水,劑量及用法同實(shí)驗(yàn)組,純凈水作為飲用水。注藥后第2周開(kāi)始,每周隨機(jī)抽取實(shí)驗(yàn)組大鼠4只、對(duì)照組大鼠1只,肝臟磁共振功能成像(DWI、MRS、PWI)后4小時(shí)內(nèi)處死大鼠,肝臟取材行HE染色、Masson三色染色、網(wǎng)狀纖維染色及透射電鏡檢查,光鏡下判定肝纖維化分期。 3.結(jié)果: 模型組共有94只大鼠完成實(shí)驗(yàn),死亡46只,死亡率33 %。模型組大鼠均出現(xiàn)不同程度的營(yíng)養(yǎng)不良、慢性肝病癥狀。肝臟病理組織學(xué)檢查見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),肝細(xì)胞壞死,膠原及網(wǎng)狀纖維增生,肝竇毛細(xì)血管化等改變。對(duì)照組20只全部存活,無(wú)相應(yīng)癥狀。肝纖維化病理分期:0期28只、1期19只、2期27只、3期25只、4期15只。 4.結(jié)論: 復(fù)合因素(CCl4+酒精)能成功地誘導(dǎo)大鼠肝纖維化,并且具有成模率高,造模周期短優(yōu)點(diǎn),并有較明顯的階段性變化;應(yīng)用復(fù)合因素可建立不同病理分期的肝纖維化模型,為肝纖維化研究提供理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?第二部分大鼠肝纖維化的MR彌散加權(quán)成像(DWI) 1.目的: 通過(guò)分析大鼠不同程度肝纖維化的DWI信號(hào)強(qiáng)度、ADC值和EADC值變化,以探討應(yīng)用非創(chuàng)性DWI檢測(cè)方法對(duì)肝臟纖維化早期診斷、量化分析及其分期的價(jià)值。 2.方法: 第一部分在大鼠給藥建立肝纖維化模型過(guò)程中,每周隨機(jī)抽取模型組大鼠4只,對(duì)照組大鼠1只,進(jìn)行MR彌散成像: SE-EPI序列,梯度因子b分別取:0s/mm2、300 s/mm2、600 s/mm2、800 s/mm2、1000 s/mm2。根據(jù)不同b值擬合得到ADC圖、EADC圖,測(cè)定不同b值彌散成像的信號(hào)強(qiáng)度,計(jì)算ADC值和EADC值,并與病理分期對(duì)照。 3.結(jié)果: (1)實(shí)驗(yàn)組大鼠隨著肝纖維化分期的增加,DWI信號(hào)強(qiáng)度呈增加趨勢(shì),各葉纖維化進(jìn)展不近相同,表現(xiàn)為DWI信號(hào)強(qiáng)度不均勻。(2)b=300、600、800、1000 s/mm2時(shí),SNR分別為(x±S):36.30±23.25、28.11±12.48、25.71±11.82和15.23±6.54,圖像質(zhì)量呈下降趨勢(shì),b=600、800 s/mm2時(shí)優(yōu)于b=1000 s/mm2(P㩳0.05)。(3)ADC值分析:對(duì)照組與1期、2期、3期、4期肝纖維化平均ADC值分別為[(x±S)×10-3]:(1.542±0.299)×10-3、(1.334±0.268)×10-3、(1.108±0.198)×10-3、(0.978±0.169)×10-3、(0.680±0.260)×10-3 ,呈下降趨勢(shì)。對(duì)照組與1期、2期、3期、4期比較有顯著性差異;1期與2期、3期、4期比較,2期與4期比較,3期與4期比較均有顯著性差異;2期與3期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ADC值與肝纖維化分期的相關(guān)性分析:r=-0.766(p㩳0.001)。(4)EADC值分析:對(duì)照組與1期、2期、3期、4期肝纖維化平均EADC值分別為[(x±S)×10-3]:(0.315±0.068)×10-3、(0.345±0.081)×10-3、(0.411±0.074)×10-3、(0.465±0.056)×10-3、(0.595±0.106)×10-3,呈增高趨勢(shì)。對(duì)照組與2期、3期、4期比較有顯著性差異,1期與2期、3期、4期比較,2期與4期比較,3期與4期比較均有顯著性差異。對(duì)照組與1期比較,2期與3期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。EADC值與肝纖維化分期的相關(guān)性分析:r=0.753 (p㩳0.001)。 4.結(jié)論: (1)DWI信號(hào)強(qiáng)度隨著肝纖維化分期的增加而增高,各葉纖維化進(jìn)展不近相同; (2)梯度因子b取600 s/mm2或800 s/mm2時(shí),即可避免灌注對(duì)彌散的影響(低b值),又具有較高的信噪比,為肝臟DWI成像較理想的b值取值;(3)ADC值(1-4期)和EADC值(2-4期)均能對(duì)肝纖維化進(jìn)行分期,且均具有較好的相關(guān)性。 第三部分大鼠肝纖維化的MR波譜成像(1H-MRS) 1.目的: 通過(guò)分析大鼠不同程度肝纖維化的MRS代謝物波峰峰高、波峰下面積及其相互比值的變化,以探討應(yīng)用MRS檢測(cè)方法對(duì)肝纖維化早期診斷、量化分析及其分期的價(jià)值。 2.方法: 第一部分在大鼠給藥建立肝纖維化模型過(guò)程中,每周隨機(jī)抽取模型組大鼠4只,對(duì)照組大鼠1只,采用3D PRESS多體素1H-MRS序列進(jìn)行MR波譜成像,手動(dòng)標(biāo)記波譜圖像中不同代謝物,軟件自動(dòng)生成各代謝物的峰高和波峰下面積,分別計(jì)算代謝物與脂質(zhì)的峰高、波峰下面積的比值(Cho/lip、Glx/lip、Lac/lip、Cr/lip)并與病理分期對(duì)照。 3.結(jié)果: 對(duì)照組大鼠肝臟波譜成像可見(jiàn)5個(gè)主要波峰;模型組大鼠脂質(zhì)峰下降,其余代謝物波峰不同程度增高。代謝物與脂質(zhì)波峰峰高比值:(1)對(duì)照組與1期、2期、3期、 4期肝纖維化Cho/lip比值分別為(x±S):0.052±0.034、0.212±0.225、0.117±0.122、0.403±0.299、0.438±0.295。對(duì)照組與3期、4期比較P㩳0.05,對(duì)照組與1期、2期比較,1期、2期分別與各組比較P㧐0.05。(2)對(duì)照組與1期、2期、3期、4期肝纖維化Glx/lip比值分別為(x—±S):0.150±0.132、0.406±0.650、0.656±0.551、0.750±0.452、0.763±0.517。對(duì)照組與2期、3期、4期比較P㩳0.05,與1期比較P㧐0.05,余各組兩兩比較P㧐0.05。(3)對(duì)照組與1期、2期、3期、4期肝纖維化Lac/lip比值分別為(x—±S):0.139±0.128、0.262±0.178、0.251±0.344、0.355±0.446、0.233±0.185,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㧐0.05),但隨分期增加有增高趨勢(shì)。(4)對(duì)照組與1期、2期、3期、4期肝纖維化Cr/lip比值分別為(x±S):0.136±0.274、0.767±0.902、0.638±0.960、0.917±0.576、0.778±0.856。對(duì)照組與3期比較P㩳0.05,余各組兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。代謝物與脂質(zhì)波峰峰高比值與肝纖維化分期的相關(guān)性分析:Cho/lip(r=0.503 p㩳0.001)、Glx/lip(r=0.388 p㩳0.05)、Lac/lip(r=0.124 p㧐0.05)、Cr/lip(r=0.235 p㧐0.05)。 肝臟主要代謝物與脂質(zhì)波峰下面積比值:(1)對(duì)照組與1期、2期、3期、4期肝纖維化Cho/lip比值分別為(x±S):0.115±0.133、0.257±0.316、0.167±0.187、0.185±0.328、0.468±0.372。對(duì)照組與4期比較P㩳0.05,余兩兩比較差異無(wú)顯著性。(2)對(duì)照組與1期、2期、3期、4期肝纖維化Glx/lip比值分別為(x±S):0.045±0.039、0.540±0.318、0.448±0.364、0.482±0.402、0.531±0.336。對(duì)照組與1期、2期、3期、 4期比較P㩳0.05,余各組之間比較P㧐0.05。(3)對(duì)照組與1期、2期、3期、4期肝纖維化Lac /lip比值分別為(x—±S):0.062±0.069、0.258±0.266、0.277±0.320、0.170±0.314、0.274±0.312。差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㧐0.05),但隨分期增加有增高趨勢(shì)。(4)對(duì)照組與1期、2期、3期、4期肝纖維化Cr/lip比值分別為(x±S):0.109±0.231、0.481±0.614、0.704±0.797、0.465±0.525、0.810±0.706。對(duì)照組與4期比較P㩳0.05,與1期、2期、3期比較及余各組之間兩兩比較P㧐0.05。代謝物與脂質(zhì)波峰下面積比值與肝纖維化分期的相關(guān)分析:Cho/lip(r=0.282 p㧐0.05)、Glx/lip(r=0.313 p㩳0.05)、Lac/lip(r=0.135 p㧐0.05)、Cr/lip(r=0.267 p㧐0.05)。 4.結(jié)論: (1)Cho/lip、Glx/lip、Cr/lip波峰峰高比值對(duì)肝纖維化分期(Cho/lip對(duì)3-4期、Glx/lip對(duì)2-4期、Cr/lip對(duì)3期)具有一定的價(jià)值;代謝物與脂質(zhì)波峰峰高比值與肝纖維化分期的相關(guān)性以Cho/lip、Glx/lip較高。(2)Cho/lip、Glx/lip、Cr/lip波峰下面積比值對(duì)肝纖維化分期(Cho/lip、Cr/lip對(duì)4期;Glx/lip對(duì)1～4期)具有一定的價(jià)值;代謝物與脂質(zhì)波峰下面積比值與肝纖維化分期的相關(guān)性以Glx/lip較高(。3)Lac/lip波峰峰高比值、波峰下面積比值對(duì)肝纖維化分期均無(wú)意義,但均隨分期增加呈增高趨勢(shì)。 第四部分大鼠肝纖維化的MR灌注成像(PWI) 1.目的: 通過(guò)分析不同程度肝纖維化的PWI的灌注參數(shù)變化,以探討應(yīng)用PWI檢測(cè)方法對(duì)肝臟纖維化早期診斷、量化分析及其分期的價(jià)值。 2.方法: 第一部分在大鼠給藥建立肝纖維化模型過(guò)程中,每周隨機(jī)抽取模型組大鼠4只,對(duì)照組大鼠1只,采用單次激發(fā)SE-EPI序列進(jìn)行MR灌注成像:經(jīng)大鼠尾靜脈快速團(tuán)注Gd-BOPTA,劑量為0.2mmol/kg體重,流率2ml/s,連續(xù)掃40個(gè)動(dòng)態(tài),覆蓋整個(gè)肝臟。應(yīng)用Perfusion軟件自動(dòng)生成肝實(shí)質(zhì)信號(hào)強(qiáng)度-時(shí)間曲線(xiàn),計(jì)算相關(guān)參數(shù):(1)最大信號(hào)下降百分率(SRRmax),(2)到達(dá)峰值時(shí)間(TTP),(3)平均通過(guò)時(shí)間(MTT)。分析PWI灌注參數(shù)值并與病理肝纖維化分期對(duì)照。 3.結(jié)果: (1)肝實(shí)質(zhì)信號(hào)強(qiáng)度-時(shí)間曲線(xiàn):對(duì)照組曲線(xiàn)呈快速下降、達(dá)峰值后緩慢恢復(fù),恢復(fù)幅度較大,恢復(fù)時(shí)程較短;模型組曲線(xiàn)下降速度減慢,下降幅度減小,達(dá)峰值時(shí)間延長(zhǎng),達(dá)峰值后恢復(fù)幅度較小,恢復(fù)時(shí)程較長(zhǎng),波峰寬大,隨著肝纖維化分期的增高這種改變更加明顯。(2)肝臟灌注參數(shù)與肝纖維化分期的關(guān)系:1)對(duì)照組與1期、2期、3期、4期肝纖維化SRRmax值分別為[(x±S)×100%]:0.754±0.073、0.674±0.137、0.632±0.154、0.603±0.201、0.535±0.135。對(duì)照組與3期、4期比較P㩳0.05,與1期、2期比較差異無(wú)顯著性,余各組兩兩比較P㧐0.05。2)對(duì)照組與1期、2期、3期、4期肝纖維化TTP值分別為[(x±S)s]:14.175±4.845、18.433±7.293、26.789±3.621、31.755±7.308、35.213±6.322。對(duì)照組與2期、3期、4期比較P㩳0.05,與1期比較無(wú)顯著性差異;1期與2期、3期、4期比較,2期與4期比較P㩳0.05;2期與3期比較,3期與4期比較P㧐0.05。3)對(duì)照組與1期、2期、3期、4期肝纖維化MTT值分別為[(x—±S)s]:24.620±5.577、28.945±2.758、32.502±4.268、35.861±4.651、35.203±5.674。對(duì)照組與2期、3期、4期比較P㩳0.05, 1期與3期、4期比較P㩳0.05,對(duì)照組與1期比較,1期與2期比較,2期與3期、4期比較,3期與4期比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肝臟灌注參數(shù)與肝纖維化分期的相關(guān)分析:SRRmax(r=-0.439 p㩳0.05)、TTP(r=0.798 p㩳0.001)、MTT(r=0.647 p㩳0.001)。 4.結(jié)論: (1)肝纖維化大鼠肝實(shí)質(zhì)信號(hào)強(qiáng)度-時(shí)間曲線(xiàn)呈慢降緩升型,波峰低平寬大;(2)SRRmax、TTP、MTT灌注參數(shù)分析有助于肝纖維化分期(SRRmax對(duì)3-4期、TTP、MTT對(duì)2-4期)。SRRmax、TTP、MTT灌注參數(shù)與肝纖維化分期均有較好的相關(guān)性,其中以TTP和MTT較高。 第五部分大鼠肝纖維化的肝細(xì)胞特異性對(duì)比劑MR成像 1.目的: 通過(guò)對(duì)大鼠肝纖維化模型進(jìn)行Gd-BOPTA增強(qiáng)動(dòng)態(tài)觀測(cè),分析不同程度肝纖維化各延遲時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)增強(qiáng)表現(xiàn)、強(qiáng)化程度,并與病理分期對(duì)照,以探討應(yīng)用Gd-BOPTA增強(qiáng)延遲掃描方法對(duì)肝臟纖維化早期診斷、定量分析及其分期的價(jià)值。 2.方法: 第一部分在大鼠給藥建立肝纖維化模型過(guò)程中,每周隨機(jī)抽取模型組大鼠4只,對(duì)照組大鼠1只,進(jìn)行Gd-BOPTA增強(qiáng)MR掃描:經(jīng)大鼠尾靜脈快速團(tuán)注Gd-BOPTA,劑量為0.2mmol/kg體重,以TSE-T1WI序列分別于注射對(duì)比劑后60min(RER1)、120 min(RER2)、180 min(RER3)時(shí)間點(diǎn)延遲掃描,分別測(cè)算各不同時(shí)間點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度、肝實(shí)質(zhì)相對(duì)強(qiáng)化率;觀察不同程度肝纖維化大鼠各不同時(shí)間點(diǎn)的膽管、血管信號(hào)強(qiáng)度變化特點(diǎn)。 3.結(jié)果: 不同時(shí)間點(diǎn)肝實(shí)質(zhì)相對(duì)強(qiáng)化率與肝纖維化分期的關(guān)系:(1)對(duì)照組與1期、2期、3期、4期肝纖維化RER1值分別為(x±S):1.436±0.374、1.487±0.477、1.476±0.440、1.489±0.431、1.476±0.436。各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㧐0.05),但隨肝纖維化分期的增加有增高趨勢(shì)。(2)對(duì)照組與1期、2期、3期、4期肝纖維化RER2值分別為(x—±S):1.220±0.370、1.292±0.387、1.344±0.367、1.371±0.388、1.405±0.370。各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㧐0.05),但隨肝纖維化分期的增加有增高趨勢(shì)。(3)對(duì)照組與1期、2期、3期、4期肝纖維化RER3值分別為(x±S):0.844±0.275、0.910±0.380、1.041±0.399、1.209±0.299、1.241±0.398。對(duì)照組與3期、4期比較P㩳0.05,與1期、2期比較P㧐0.05,肝纖維化各期之間兩兩比較P㧐0.05。不同時(shí)間點(diǎn)肝實(shí)質(zhì)相對(duì)強(qiáng)化率與肝纖維化分期的相關(guān)分析:RER1(r=0.039 p㧐0.05)、RER2(r=0.174 p㧐0.05)、RER3(r=0.420 p㩳0.05)。膽管、血管顯影情況: MR增強(qiáng)延遲期:肝內(nèi)血管樹(shù)T1WI為低信號(hào);膽道樹(shù)T1WI表現(xiàn)為高信號(hào)。實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟門(mén)靜脈樹(shù)和膽管樹(shù)分支走行迂曲、粗細(xì)變化不規(guī)律,膽管樹(shù)見(jiàn)延遲強(qiáng)化。 4.結(jié)論: (1)對(duì)比劑Gd-BOPTA增強(qiáng)后60min、120 min時(shí)間點(diǎn)肝實(shí)質(zhì)相對(duì)強(qiáng)化率對(duì)肝纖維化分期無(wú)價(jià)值,延遲后180 min時(shí)間點(diǎn)肝實(shí)質(zhì)相對(duì)強(qiáng)化率對(duì)肝纖維化分期(3-4期)具有一定的價(jià)值,不能對(duì)早期肝纖維化(1-2期)進(jìn)行分期。(2)肝纖維化大鼠膽管樹(shù)形態(tài)改變、延遲強(qiáng)化,提示肝纖維化時(shí)膽系重構(gòu)、肝細(xì)胞功能受損。 第二篇磁粒子標(biāo)記大鼠BMSCs移植修復(fù)肝損傷的MR活體示蹤實(shí)驗(yàn)研究 肝功能衰竭是各種慢性肝病主要的死亡原因,原位肝移植是目前治療終末期肝病的最有效的方法,但由于供肝嚴(yán)重缺乏,遠(yuǎn)無(wú)法滿(mǎn)足臨床需求。肝臟的細(xì)胞移植為病損肝臟的細(xì)胞重建和衰竭肝臟的功能恢復(fù)提供了一種新的治療策略,使患者有可能利用自身的骨髓干細(xì)胞作為種子細(xì)胞,來(lái)修復(fù)自體組織的病變和損傷。干細(xì)胞移植示蹤研究,對(duì)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)活體內(nèi)移植細(xì)胞的分布、遷移、分化及評(píng)估細(xì)胞移植效果具有重要作用,但干細(xì)胞移植示蹤技術(shù)一直是醫(yī)學(xué)科研中的難題。傳統(tǒng)的移植細(xì)胞的示蹤方法必須在離體狀態(tài)下通過(guò)組織學(xué)觀察來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此,迫切需要建立一種安全無(wú)創(chuàng)、敏感有效、適于臨床的移植細(xì)胞活體示蹤技術(shù)。MR活體示蹤在干細(xì)胞的研究中日益受到關(guān)注,利用MR敏感的對(duì)比劑作為分子探針標(biāo)記供體移植細(xì)胞,移植后對(duì)受體進(jìn)行MRI檢測(cè)是活體觀察移植細(xì)胞存活和分布的新技術(shù)。 應(yīng)用MR活體示蹤技術(shù)研究肝纖維化形成環(huán)境中移植的BMSCs分布、遷移規(guī)律尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)大鼠BMSCs的分離、增殖和鑒定,采用Brdu和SPIO雙標(biāo)記大鼠BMSCs,對(duì)大鼠肝纖維化模型進(jìn)行同種異體移植后,行MR活體動(dòng)態(tài)觀測(cè),并與病理組織學(xué)對(duì)照,以探討大鼠BMSCs的分離、增殖和鑒定技術(shù),和SPIO作為分子探針標(biāo)記BMSCs MR活體示蹤的可行性,以及MR成像的最佳掃描參數(shù)及成像序列,并探討移植細(xì)胞在肝臟纖維化環(huán)境中分布、遷移特點(diǎn)及其對(duì)肝損傷的修復(fù)作用,以及相應(yīng)的MR信號(hào)變化規(guī)律,探索臨床應(yīng)用型1.5T MR用于干細(xì)胞示蹤研究的可行性,為干細(xì)胞移植MR活體示蹤的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 第一部分大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)、鑒定和標(biāo)記 1.目的: 觀察大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)的條件,并利用Brdu和超順磁性氧化鐵顆粒對(duì)大鼠BMSCs進(jìn)行雙標(biāo)記,為應(yīng)用MR對(duì)移植骨髓基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行活體示蹤研究奠定基礎(chǔ)。 2.方法: 取60~90g SD大鼠,體外培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞,利用倒置相差顯微鏡觀察原代及不同傳代細(xì)胞生長(zhǎng)、形態(tài)特點(diǎn),并應(yīng)用流式細(xì)胞儀鑒定原代及不同傳代細(xì)胞表型。利用Brdu和PLL介導(dǎo)的超順磁性氧化鐵顆粒對(duì)大鼠BMSCs進(jìn)行雙標(biāo)記。 3.結(jié)果: 培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞第3代,骨髓基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志CD90表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞已占到93.1%。造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志CD45表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞已從原代的71.2%降低到3.9%。PLL介導(dǎo)的超順磁性氧化鐵顆粒對(duì)大鼠BMSCs標(biāo)記率達(dá)100%。 4.結(jié)論: 傳代3的BMSCs可作為細(xì)胞移植治療的理想細(xì)胞來(lái)源。PLL介導(dǎo)的超順磁性氧化鐵顆�？筛咝实貥�(biāo)記大鼠BMSCs。 第二部分磁粒子標(biāo)記大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的體外MR成像實(shí)驗(yàn) 1.目的: 探討標(biāo)記細(xì)胞不同細(xì)胞數(shù)量所引起的MR信號(hào)強(qiáng)度變化規(guī)律,以及磁粒子標(biāo)記細(xì)胞MR示蹤最敏感的成像序列,為標(biāo)記細(xì)胞活體內(nèi)MR示蹤奠定基礎(chǔ),并提供理論依據(jù)。 2.方法: 用1%的瓊脂糖混懸Brdu和SPIO雙標(biāo)記的BMSCs(分別為2×106、1×106、5×105個(gè))和未標(biāo)記的BMSCs (2×106個(gè)),分別置于不同EP管中。行冠狀位和軸位TSE序列T1WI、T2WI和FFE-T2WI掃描,測(cè)量相同細(xì)胞數(shù)量不同成像序列以及相同成像序列不同細(xì)胞數(shù)量的信號(hào)強(qiáng)度,并比較MR信號(hào)變化率。 3.結(jié)果: 磁粒子標(biāo)記的各不同數(shù)量BMSCs各成像序列MR信號(hào)變化率(:1)標(biāo)記組5×105、1×106、2×106個(gè)細(xì)胞TSE-T1WI序列MR信號(hào)變化率分別為[(x±S)%]:-4.19±0.79、-16.35±1.23、-22.80±1.05。(2))標(biāo)記組5×105、1×106、2×106個(gè)細(xì)胞TSE-T2WI序列MR信號(hào)變化率分別為[(x—±S)%]:-14.15±1.37、-35.09±1.39、-53.02±1.30。(3)標(biāo)記組5×105、1×106、2×106個(gè)細(xì)胞FFE-T2WI序列MR信號(hào)變化率分別為[(x±S)%]:-44.98±0.46、-69.38±0.82、-87.24±0.82。同一掃描序列中各標(biāo)記細(xì)胞組之間以及相同標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量各成像序列之間兩兩比較P㩳0.001,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.結(jié)論: 磁粒子標(biāo)記BMSCs,細(xì)胞濃度相同條件下,以FFE-T2WI序列信號(hào)下降最為明顯,標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量越多,信號(hào)改變?cè)矫黠@,呈細(xì)胞數(shù)量依賴(lài)性。FFE-T2WI序列為磁粒子標(biāo)記細(xì)胞MR示蹤的理想序列。 第三部分大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的同種異體肝移植 1.目的: 經(jīng)門(mén)靜脈途徑和肝內(nèi)途徑進(jìn)行肝臟的BMSCs移植,探討兩種移植途徑的特點(diǎn),為比較兩種移植途徑的MR示蹤效果及信號(hào)變化特點(diǎn),及了解移植細(xì)胞在靶器官的分布、遷移規(guī)律奠定基礎(chǔ)。 2.方法: 將第一篇、第一部分中建立的SD大鼠肝纖維化模型20只分為4組,1組:生理鹽水對(duì)照組(注射不含BMSCs的等容生理鹽水,其中經(jīng)門(mén)靜脈2只,經(jīng)肝內(nèi)注射2只);2組:未標(biāo)BMSCs對(duì)照組(移植2×106個(gè)未經(jīng)Brdu和SPIO標(biāo)記的BMSCs,其中經(jīng)門(mén)靜脈2只,經(jīng)肝內(nèi)注射2只);3組:經(jīng)門(mén)靜脈移植BMSCs標(biāo)記組(經(jīng)門(mén)靜脈移植2×106個(gè)經(jīng)Brdu和SPIO標(biāo)記的BMSCs,6只);4組:經(jīng)肝內(nèi)移植BMSCs標(biāo)記組(經(jīng)肝內(nèi)移植2×106個(gè)經(jīng)Brdu和SPIO標(biāo)記的BMSCs,6只)。手術(shù)暴露門(mén)靜脈主干和肝臟,以微量注射器抽取相應(yīng)移植內(nèi)容,穿刺各組目標(biāo),緩慢注入。 3.結(jié)果: 經(jīng)肝內(nèi)注射組:手術(shù)操作簡(jiǎn)便,細(xì)胞移植順利。經(jīng)門(mén)靜脈移植組:有3只大鼠因腹膜、系膜粘連,門(mén)靜脈主干分離困難,給移植手術(shù)帶來(lái)一定的難度,其余大鼠移植手術(shù)順利。因?qū)嶒?yàn)大鼠均出現(xiàn)門(mén)靜脈主干不同程度增粗,門(mén)靜脈主干穿刺均獲成功。緩慢注入移植細(xì)胞或生理鹽水后,大鼠未出現(xiàn)異常反應(yīng)。手術(shù)切口愈合良好。 4.結(jié)論: 經(jīng)門(mén)靜脈途徑和經(jīng)肝內(nèi)注射途徑對(duì)肝臟進(jìn)行BMSCs移植,安全、易行。 第四部分大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞同種異體肝移植的MR活體示蹤研究 1.目的: 探討經(jīng)門(mén)靜脈途徑和經(jīng)肝內(nèi)途徑移植標(biāo)記細(xì)胞的MR活體示蹤效果及信號(hào)變化特點(diǎn),從而了解肝纖維化環(huán)境中移植細(xì)胞在靶器官的分布、遷移規(guī)律及其對(duì)肝損傷的修復(fù)作用,為移植干細(xì)胞MR活體示蹤的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 2.方法: 第三部分移植術(shù)后各組大鼠每組隨機(jī)抽取2只,分別于移植術(shù)后2h、3d、7d、2w行TSE序列軸位T2WI-SPAIR、T1WI和FFE-T2WI掃描,對(duì)不同序列圖像的移植細(xì)胞顯影效果進(jìn)行比較;觀察各移植組不同時(shí)間點(diǎn)的MR信號(hào)強(qiáng)度、分布范圍及其變化規(guī)律。于MR掃描后隨機(jī)抽取每組大鼠各一只處死,取肝臟標(biāo)本,并取部分大鼠肺和脾臟組織,采用HE染色、含鐵血黃素染色、Brdu免疫組織化學(xué)染色。觀察含鐵血黃素染色陽(yáng)性細(xì)胞和Brdu免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性細(xì)胞在肝、肺、脾臟中的分布。 3.結(jié)果: (1)MR檢查:在各掃描序列中,以FFE-T2WI序列成像效果最佳。1組和2組:移植術(shù)后2h、3d、7d、2w不同時(shí)間點(diǎn)、各序列MR圖像均未見(jiàn)異常信號(hào)改變。3組:移植術(shù)后2h,肝門(mén)區(qū)見(jiàn)多發(fā)結(jié)節(jié)狀低信號(hào)灶,并隨時(shí)間延長(zhǎng)向肝內(nèi)分散,低信號(hào)結(jié)節(jié)逐漸變小。移植術(shù)后2w示蹤效果較差。4組:移植術(shù)后2h,局部見(jiàn)團(tuán)狀低信號(hào)灶,隨時(shí)間延長(zhǎng)范圍逐漸擴(kuò)大,邊緣逐漸模糊,移植術(shù)后2w低信號(hào)區(qū)仍較明顯。 (2)病理組織學(xué)檢查:1)HE染色:移植術(shù)后2h、3d各組肝內(nèi)壞死、炎癥及纖維組織增生情況基本類(lèi)似;移植術(shù)后7d、2w,與1組比較,2～4組大鼠肝組織壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況逐漸好轉(zhuǎn),以經(jīng)門(mén)靜脈移植組明顯。2)含鐵血黃素染色:1組和2組:移植術(shù)后2h、3d、7d、2w,肝臟、肺和脾臟含鐵血黃素染色,均未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞。3組:移植術(shù)后2h含鐵血黃素染色陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于肝門(mén)部門(mén)靜脈內(nèi),移植術(shù)后3d陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于門(mén)靜脈小分支、肝竇內(nèi)、肝小葉中央靜脈周?chē)?移植術(shù)后7d、2w陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于損傷較重的肝實(shí)質(zhì)和纖維間隔;各時(shí)間點(diǎn)組織學(xué)所見(jiàn)與MR成像信號(hào)改變一致。同期的肺和脾臟含鐵血黃素染色,其內(nèi)可見(jiàn)少量陽(yáng)性細(xì)胞散在分布。4組:移植術(shù)后2h、3d、7d、2w可見(jiàn)含鐵血黃素染色陽(yáng)性細(xì)胞密集分布于注射點(diǎn),隨時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞向周?chē)蝺?nèi)遷移。各時(shí)間點(diǎn)組織學(xué)所見(jiàn)與MR成像信號(hào)改變一致。同期肺內(nèi)未見(jiàn)明顯陽(yáng)性細(xì)胞,脾臟內(nèi)可見(jiàn)少量陽(yáng)性細(xì)胞分布。3)Brdu免疫組織化學(xué)染色:結(jié)果與含鐵血黃素染色一致。 4.結(jié)論: (1)FFE-T2WI序列為肝內(nèi)移植磁粒子標(biāo)記細(xì)胞MR活體示蹤的理想序列;(2)經(jīng)門(mén)靜脈途徑移植BMSCs細(xì)胞隨時(shí)間逐漸向肝內(nèi)移行,以損傷較重區(qū)和纖維間隔分布明顯,具有選擇性分布特點(diǎn);移植的部分BMSCs與肝細(xì)胞緊密連接,形成規(guī)則的肝細(xì)胞索,對(duì)肝損傷具有修復(fù)作用;經(jīng)門(mén)靜脈途徑移植BMSCs為細(xì)胞移植治療肝臟彌漫性病變的較理想途徑,但MR示蹤時(shí)間窗較短;經(jīng)肝內(nèi)途徑移植BMSCs細(xì)胞分布局限,MR示蹤時(shí)間窗較長(zhǎng);(3)MR信號(hào)變化規(guī)律與組織學(xué)證實(shí)的移植細(xì)胞在靶器官的分布、遷移規(guī)律具有較好的一致性;(4)MR信號(hào)變化規(guī)律在一定程度上反映了移植細(xì)胞在肝內(nèi)的分布、遷移、增殖和分化狀態(tài);(5)臨床應(yīng)用型1.5T MR可用于肝臟干細(xì)胞移植的活體示蹤研究。 結(jié)論 1.應(yīng)用復(fù)合因素(CCl4+酒精)能成功地建立不同病理分期的大鼠肝纖維化模型,有較明顯的階段性變化。 2. DWI信號(hào)強(qiáng)度隨著肝纖維化分期的增加而增高;梯度因子600 s/mm2或800 s/mm2為肝臟DWI成像較理想的b值取值;ADC值和EADC值均能對(duì)肝纖維化進(jìn)行分期(ADC值對(duì)1-4期;EADC值對(duì)2-4期),具有較好的相關(guān)性。 3. Cho/lip、Glx/lip、Cr/lip波峰峰高比值(Cho/lip對(duì)3-4期、Glx/lip對(duì)2-4期、Cr/lip對(duì)3期)及波峰下面積比值(Cho/lip對(duì)4期、Glx/lip對(duì)1-4期、Cr/lip對(duì)4期)對(duì)肝纖維化具有一定的分期價(jià)值;Lac/lip波峰峰高及波峰下面積比值對(duì)肝纖維化分期均無(wú)意義。 4.肝纖維化大鼠肝實(shí)質(zhì)時(shí)間-信號(hào)強(qiáng)度曲線(xiàn)呈慢降緩升型,波峰低平寬大;灌注參數(shù)SRRmax(對(duì)3-4期)、TTP(對(duì)2-4期)、MTT(對(duì)2-4期)對(duì)肝纖維化分期具有一定的價(jià)值。 5. Gd-BOPTA增強(qiáng)后延遲60min、120 min時(shí)間點(diǎn)肝實(shí)質(zhì)相對(duì)強(qiáng)化率對(duì)肝纖維化分期無(wú)價(jià)值,延遲180 min時(shí)間點(diǎn)肝實(shí)質(zhì)相對(duì)強(qiáng)化率對(duì)肝纖維化分期(3-4期)具有一定的價(jià)值,但對(duì)較早期肝纖維化分期(1-2期)不敏感。 6.傳代3的BMSCs細(xì)胞可作為細(xì)胞移植治療的理想細(xì)胞來(lái)源;SPIO-PLL可高效率標(biāo)記大鼠BMSCs。 7.在體外,FFE-T2WI序列信號(hào)下降程度隨標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量增多而增大,示蹤效果呈標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量依賴(lài)性。 8.在活體,FFE-T2WI序列為磁粒子標(biāo)記BMSCs肝移植MR示蹤的理想序列。 9.經(jīng)門(mén)靜脈途徑肝臟BMSCs細(xì)胞移植為細(xì)胞移植治療肝臟彌漫性病變的較理想途徑。 10.在肝纖維化環(huán)境中,移植的BMSCs隨時(shí)間逐漸向肝實(shí)質(zhì)和纖維間隔內(nèi)移行,以損傷較重區(qū)和纖維間隔分布明顯,具有選擇性分布特點(diǎn);移植的BMSCs能與肝細(xì)胞緊密連接,形成規(guī)則的肝細(xì)胞索,對(duì)肝損傷具有修復(fù)作用。但經(jīng)門(mén)靜脈移植BMSCs MR示蹤時(shí)間窗較短;經(jīng)肝內(nèi)途徑移植BMSCs細(xì)胞分布局限,MR示蹤時(shí)間窗較長(zhǎng)。 11. MR信號(hào)變化規(guī)律與組織學(xué)證實(shí)的移植細(xì)胞在靶器官的分布、遷移規(guī)律具有較好的一致性;MR信號(hào)變化規(guī)律在一定程度上反映了移植細(xì)胞在肝內(nèi)的分布、遷移、增殖和分化狀態(tài)。 12.臨床應(yīng)用型1.5T MR可用于肝臟干細(xì)胞移植的活體示蹤研究。
【圖文】：

3 期：纖維間隔伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無(wú)肝硬化。4 期：早期肝硬化。6. 透射電子顯微鏡觀察肝組織超微結(jié)構(gòu)變化包括肝細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞核、細(xì)胞器變化，肝竇形態(tài)、內(nèi)皮細(xì)胞變化，Disse 間隙、肝小葉內(nèi)纖維組織增生等。結(jié) 果1.動(dòng)物生存狀況 160 只 SD(Sprague-Dawley)大鼠，對(duì)照組 20 只，實(shí)驗(yàn)組 140 只。實(shí)驗(yàn)組大鼠每次皮下注射 40%CCl4油溶液約 5~10min 后，出現(xiàn)四肢癱軟，腹肌松弛，嗜睡，食欲下降。隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，食欲逐漸下降，精神萎靡，活動(dòng)減少，易怒好斗，出現(xiàn)易出血傾向；體重逐漸減輕，，消瘦，出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)不良，毛發(fā)蓬亂、無(wú)光澤（圖1b），尿黃，部分大鼠出現(xiàn)稀便。實(shí)驗(yàn)組共有 94 只大鼠完成實(shí)驗(yàn)，死亡 46 只，死亡率 33%。對(duì)照組大鼠未出現(xiàn)上述表現(xiàn)，且體重逐漸增加，毛發(fā)有光澤（圖 1c），全部存活。

活動(dòng)減少，易怒好斗，出現(xiàn)易出血傾向；體重逐漸減輕，消瘦，出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)不良，毛發(fā)蓬亂、無(wú)光澤（圖1b），尿黃，部分大鼠出現(xiàn)稀便。實(shí)驗(yàn)組共有 94 只大鼠完成實(shí)驗(yàn)，死亡 46 只，死亡率 33%。對(duì)照組大鼠未出現(xiàn)上述表現(xiàn)，且體重逐漸增加，毛發(fā)有光澤（圖 1c），全部存活。圖 1a 99.9%分析純 CCl4圖 1b 實(shí)驗(yàn)組大鼠營(yíng)養(yǎng)不良，毛發(fā)蓬亂圖 1c 對(duì)照組大鼠
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R575.2;R445.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 楊志軍,徐如祥,姜曉丹,柯以銓,魏黎,雷皓,溫志波,曹容,段麗,饒志仁,魏玲,蔡穎謙,杜謀選,鄒雨汐;菲立磁標(biāo)記大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞及自體移植后磁共振示蹤的研究[J];中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志;2005年02期

2 曾林,王慧芳,胡仲明;肝纖維化動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2003年06期

3 景猛;劉新權(quán);劉恩重;;神經(jīng)干細(xì)胞超順磁性氧化鐵納米粒子標(biāo)記和體內(nèi)MRI示蹤[J];中華神經(jīng)外科疾病研究雜志;2006年01期

4 景猛;劉新權(quán);梁鵬;張相彤;李長(zhǎng)宇;王丹;劉恩重;;納米鐵粒子標(biāo)記人骨髓基質(zhì)細(xì)胞及移植后MRI示蹤的臨床研究[J];中華神經(jīng)外科疾病研究雜志;2007年01期

5 王建利,謝敬霞;成人腦組織水分子擴(kuò)散的各向異性[J];中華放射學(xué)雜志;1999年10期

6 居勝紅,滕皋軍,毛曦,張愛(ài)鳳,張宇,馬明,顧寧;臍血間充質(zhì)干細(xì)胞磁探針標(biāo)記和MR成像研究[J];中華放射學(xué)雜志;2005年01期

7 居勝紅;滕皋軍;陸海華;張愛(ài)鳳;張宇;馬明;;大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞超順磁性氧化鐵標(biāo)記和經(jīng)脾移植后的MR示蹤研究[J];中華放射學(xué)雜志;2006年02期

8 蔡金華;馮敢生;王新;吳漢平;趙建農(nóng);郭大靖;余國(guó)容;黎川;劉官信;王世一;;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞磁標(biāo)記及MR成像研究[J];中華放射學(xué)雜志;2006年02期

9 中華肝臟病學(xué)會(huì)肝纖維化學(xué)組;肝纖維化診斷及療效評(píng)估共識(shí)[J];中華肝臟病雜志;2002年05期

10 展玉濤,魏來(lái),陳紅松,叢旭,費(fèi)然,王宇;骨髓干細(xì)胞在大鼠肝纖維化形成環(huán)境中的分化[J];中華肝臟病雜志;2003年11期

本文編號(hào)：2690341