本文關(guān)鍵詞：X-射線照射后A549細(xì)胞釋放的exosome對同源細(xì)胞及巨噬細(xì)胞功能的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:放療是治療腫瘤的有效方法之一,但臨床上發(fā)現(xiàn)放療后循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs)數(shù)目增加,并通過循環(huán)腫瘤細(xì)胞造成腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。目前認(rèn)為腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體(Tumor Derived Exosome,TD-exosomes)可參與并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,但放療后殘存腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體的功能是否發(fā)生改變,即對腫瘤細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞的作用還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用A549細(xì)胞釋放的exosome(A549/exo)和X-射線照射A549細(xì)胞株后提取的exosomes(irr-A549/exo),觀察了其對同源細(xì)胞(即A549細(xì)胞)增殖、遷移及巨噬細(xì)胞Thp-1產(chǎn)生炎癥因子的影響,為放療導(dǎo)致的腫瘤復(fù)發(fā)和遷移提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。方法:1不同劑量X-射線照射對A549細(xì)胞增殖及凋亡的影響體外培養(yǎng)A549細(xì)胞株,采用X照射直線加速器進(jìn)行照射,劑量分別為10Gy、20Gy及30Gy,對照組細(xì)胞不進(jìn)行照射。然后將X射線處理后的細(xì)胞分別培養(yǎng)在96孔或6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h,MTS方法觀察A549細(xì)胞增殖;6孔板的細(xì)胞,在繼續(xù)培養(yǎng)24h后,收集細(xì)胞,部分細(xì)胞采用75%乙醇固定,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期;另外部分細(xì)胞采用Annexin V/PE及7AAD進(jìn)行標(biāo)記,流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率。2 exosomes的制備及電鏡觀察收集體外培養(yǎng)的A549及經(jīng)X射線照射72h后A549細(xì)胞的培養(yǎng)上清,差速離心法分離提取exosomes:2000×g,10min;10,000×g,1h;然后將上清超高速110,000×g離心16 h,以少量PBS重懸所得沉淀。最后用磷鎢酸負(fù)染exosomes并在透射電鏡下觀察exosomes的形態(tài),并以Nanodrop進(jìn)行定量。3 A549細(xì)胞經(jīng)X-射線照射后分泌的exosomes(irr-A549/exo)對同源A549細(xì)胞增殖及遷移的影響MTS實(shí)驗(yàn)、Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、劃痕試驗(yàn)分別觀察A549/exo或irr-a549/exo兩種不同exosome對a549細(xì)胞增殖、遷移能力的影響。4a549/exo或irr-a549/exo對thp-1產(chǎn)生炎癥因子的影響人單核細(xì)胞thp-1經(jīng)pma誘導(dǎo)48h,使其分化為巨噬細(xì)胞。以a549/exo或irr-a549/exo分別作用于巨噬細(xì)胞12h和24h,收集培養(yǎng)上清,cba檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子tnf、il-8、il-6、il-10、il-1β和tgf-β1的表達(dá)情況。5a549/exo或irr-a549/exo對thp-1信號分子表達(dá)的影響收集a549/exo或irr-a549/exo刺激12h及24h的thp-1細(xì)胞,采用westernblot檢測nf-κbp65/p-p65及p105/p-p105、p38/p-p38、jnk/p-jnk的表達(dá)變化。結(jié)果:1a549細(xì)胞經(jīng)不同劑量放射線照射后,生長均受到不同程度的抑制,其中30gy放射線劑量可使a549細(xì)胞在72h內(nèi)的抑制率維持在50%左右;細(xì)胞凋亡率達(dá)20%以上;細(xì)胞周期阻滯在s期。2電鏡觀察到大小均一的、直徑約為100nm大小的圓形或橢圓形囊泡。3a549/exo或irr-a549/exo對a549細(xì)胞的增殖均沒有明顯影響;但劃痕實(shí)驗(yàn)顯示,與空白對照相比,a549/exo可顯著提高a549的遷移率(p0.05),irr-a549/exo促a549橫向遷移的能力更顯著,與空白組及a549/exo刺激組均有顯著差異(p0.05,p0.01)。transwell試驗(yàn)也顯示,無論將exosome置于transwell小室的下室,或用exosome處理a549細(xì)胞24h,再將該細(xì)胞加入transwell的上室,繼續(xù)培養(yǎng)24h后,穿過微孔濾膜的細(xì)胞均增加(p0.01),且irr-a549/exosome促細(xì)胞遷移的能力明顯高于a549/exo(p0.05)。4巨噬細(xì)胞thp-1經(jīng)a549/exo或irr-a549/exo刺激后,培養(yǎng)上清中il-1、il-6、tnf-α及tgf-β的水平顯著增加。5巨噬細(xì)胞thp-1經(jīng)a549/exo或irr-a549/exo刺激后12h,westernblot檢測到p-p38活性增加,且irr-a549/exo作用更明顯(p0.05)。結(jié)論:1a549經(jīng)劑量為30gy的x-射線照射后釋放的exosome,顯著促進(jìn)a549細(xì)胞的遷移;2 A549經(jīng)劑量為30Gy的X-射線照射后釋放的exosome,可促進(jìn)Thp-1細(xì)胞產(chǎn)生IL-1、IL-6、TNF-α及TGF-β;3 X-射線照射可促進(jìn)A549釋放的exosome活化p-38信號分子。
【關(guān)鍵詞】：X-射線 肺癌細(xì)胞株A549 exosome Thp-1 CBA IL-1 IL-6 TNF-α TGF-β
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.55
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文縮寫10-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-21
• 結(jié)果21-23
• 附圖23-28
• 討論28-29
• 結(jié)論29
• 參考文獻(xiàn)29-32
• 綜述 腫瘤釋放的外泌體影響腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移32-41
• 參考文獻(xiàn)36-41
• 致謝41-42
• 個(gè)人簡歷42

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本文編號：267348