【摘要】：目的：制備IL-8單克隆抗體與聲諾維(SonoVue)微泡偶聯(lián)的聲學(xué)造影劑,并探討其偶聯(lián)的方法學(xué)。在此基礎(chǔ)上,通過攜IL-8單抗靶向超聲造影劑分別與正常內(nèi)皮細(xì)胞和損傷內(nèi)皮細(xì)胞相互作用,體外評(píng)價(jià)該造影劑的靶向粘附效能,并探討IL-8在粥樣斑塊形成過程中所起的作用和評(píng)價(jià)血管內(nèi)皮功能的新方法,為臨床早期診斷和治療動(dòng)脈粥樣硬化提供新的影像學(xué)依據(jù)奠定基礎(chǔ)。 方法：1.采用SPDP交聯(lián)法將IL-8單克隆抗體與SonoVue微泡偶聯(lián)：IL-8單克隆抗體溶于PBS緩沖溶液中,加入SPDP溶液反應(yīng),離心、洗滌后得到帶毗啶二硫基的單克隆抗體；加入過量的二硫蘇糖醇(DTT)醋酸溶液,再反應(yīng)、離心、洗滌,得到帶巰基的抗體溶液。取SonoVue懸液加入SPDP溶液,洗滌后與帶巰基的抗體溶液混合反應(yīng),最終得到與IL-8單克隆抗體偶聯(lián)的聲學(xué)微泡懸液。 2.IL-8單克隆抗體偶聯(lián)聲學(xué)微泡的鑒定：(1)玻片凝集實(shí)驗(yàn)：在潔凈載玻片上,均分別與羊抗鼠IgG血清、生理鹽水混合,數(shù)分鐘后置于一普通顯微鏡下觀察微泡狀態(tài)。(2)免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)：IL-8單抗偶聯(lián)SonoVue微泡、未偶聯(lián)SonoVue微泡懸液均分別與羊抗鼠IgG-FITC混合反應(yīng),熒光顯微鏡下觀察熒光染色的效果。 3.采用含15%胎牛血清的人RPMI1640培養(yǎng)基將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)至業(yè)融合狀態(tài),經(jīng)0.25%胰酶消化后,取一部分細(xì)胞加入PBS緩沖溶液,建立正常內(nèi)皮細(xì)胞組；取另一部分細(xì)胞加入TNF-α干預(yù),建立損傷內(nèi)皮細(xì)胞組。兩組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后,行免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)細(xì)胞表面IL-8的表達(dá)水平。 4.倒置顯微鏡下觀察未偶聯(lián)SonoVue微泡、靶向性微泡分別與正常內(nèi)皮細(xì)胞、損傷內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合作用,高倍視野下計(jì)數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞及粘附的微泡數(shù)目,通過計(jì)算微泡與內(nèi)皮細(xì)胞的比值對(duì)兩者之間的結(jié)合作用進(jìn)行定量分析。 結(jié)果：1.未偶聯(lián)的SonoVue微泡大小較均一(直徑2-4μm),分布較均勻,呈單個(gè)、散在分布；IL-8單克隆抗體偶聯(lián)SonoVue微泡濃度稍低于未偶聯(lián)的SonoVue微泡濃度,但與未偶聯(lián)微泡大小、形態(tài)、性狀基本相似,無明顯變化。 2.玻片凝集實(shí)驗(yàn)中,IL-8單克隆抗體偶聯(lián)SonoVue微泡懸液與二抗(羊抗鼠IgG血清)混合液,普通顯微鏡下可見發(fā)生明顯凝集反應(yīng)；未偶聯(lián)SonoVue微泡懸液與二抗混合液、IL-8單克隆抗體偶聯(lián)SoneVue微泡懸液與生理鹽水混合液及未偶聯(lián)SonoVue微泡懸液與生理鹽水混合液,普通顯微鏡下微泡均未發(fā)生明顯凝集反應(yīng)。免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)中,僅IL-8單抗偶聯(lián)SonoVue微泡表面可見明顯綠色熒光,而未偶聯(lián)SonoVue微泡未見熒光。 3.免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示正常血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核呈藍(lán)紫色,而細(xì)胞表面幾乎未見著色；經(jīng)TNF-a誘導(dǎo)后,損傷組血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核同樣呈藍(lán)紫色,但是細(xì)胞表面幾乎著棕色。 4.倒置顯微鏡下未偶聯(lián)微泡、攜IL-8單抗微泡分別與正常內(nèi)皮細(xì)胞、損傷內(nèi)皮細(xì)胞粘附作用的定量分析顯示與正常內(nèi)皮細(xì)胞的粘附作用在兩組微泡之間均無明顯差異；而攜IL-8單抗靶向微泡與損傷內(nèi)皮細(xì)胞的粘附作用明顯高于未偶聯(lián)微泡(P0.01),未偶聯(lián)SonoVue微泡與損傷內(nèi)皮細(xì)胞的粘附作用稍高于與正常內(nèi)皮細(xì)胞的作用,但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：攜IL-8單抗靶向微泡與損傷內(nèi)皮細(xì)胞的粘附作用明顯高于正常內(nèi)皮細(xì)胞(P0.01)。 結(jié)論：1.玻片凝集實(shí)驗(yàn)可見IL-8單克隆抗體偶聯(lián)的聲學(xué)微泡混懸液與二抗混合反應(yīng)后發(fā)生了明顯的凝集反應(yīng),免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)可見IL-8單克隆抗體偶聯(lián)聲學(xué)微泡表面發(fā)出明顯綠色熒光,均說明IL-8單克隆抗體已成功偶聯(lián)到微泡外殼表面,即該靶向性造影劑的制備時(shí)成功的。 2.經(jīng)過SPDP交聯(lián)后,雖然制備的靶向微泡濃度有所減低,但是該微泡的大小、形態(tài)、性狀沒有顯著改變,說明SPDP與抗體偶聯(lián)后的聲學(xué)造影劑其物理、生物性狀是沒有改變的,仍可以作為造影劑作用于生物體內(nèi)。 3正常內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)TNF-α干預(yù)受損后,損傷內(nèi)皮細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示細(xì)胞核呈藍(lán)紫色,而細(xì)胞表面呈棕色,說明損傷內(nèi)皮細(xì)胞表面存在IL-8,證實(shí)TNF-α誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分泌IL-8成功。 4.免疫細(xì)胞化學(xué)染色證實(shí)TNF-α誘導(dǎo)后,損傷內(nèi)皮細(xì)胞分泌IL-8呈高表達(dá),可見選擇IL-8單克隆抗體作為靶向抗體偶聯(lián)到SonoVue微泡表面,可以更為準(zhǔn)確的檢測(cè)損傷內(nèi)皮細(xì)胞提供了新的方法。 5.體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)可見大量攜IL-8單克隆抗體靶向微泡粘附于損傷細(xì)胞表面,表明IL-8單克隆抗體偶聯(lián)到微泡表面后仍具有免疫活性。 6.體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)雖然可見數(shù)個(gè)未偶聯(lián)SonoVue微泡粘附于損傷細(xì)胞表面,但是顯著低于攜IL-8單克隆抗體靶向微泡的結(jié)合作用,說明采用SPDP交聯(lián)法制備的攜IL-8單抗靶向微泡與靶細(xì)胞結(jié)合的作用是高效的和特異的。 7.體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)通過攜IL-8單克隆抗體靶向微泡利用與損傷內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性抗原-抗體反應(yīng),大大提高了與損傷內(nèi)皮細(xì)胞的粘附作用,為今后應(yīng)用靶向性超聲造影技術(shù)檢測(cè)內(nèi)皮損傷、評(píng)價(jià)內(nèi)皮功能奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R445.1

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王冉;羅毅;溫紅;賴林秀;裘品丹;李堅(jiān);;超聲造影對(duì)肝臟良惡性腫瘤鑒別診斷的應(yīng)用研究[J];中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用;2011年11期

2 劉紅梅;趙素玲;屈立新;李素淑;吳浩榮;;超聲造影技術(shù)在監(jiān)測(cè)氬氦刀治療惡性腫瘤中的應(yīng)用價(jià)值[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2011年09期

3 田茂渝;楊太珠;何敏;;超聲造影在卵巢病變?cè)\斷中的應(yīng)用價(jià)值初探[J];實(shí)用婦產(chǎn)科雜志;2011年06期

4 陳維飛;;強(qiáng)直性脊柱炎患者血清IL-18水平及臨床意義[J];現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué);2011年15期

5 張巧;謝惠玲;邢瑞婷;康雪敬;龔春梅;李春陽;吳衛(wèi)東;;香煙煙霧凝集物對(duì)BEAS-2B細(xì)胞損傷作用及對(duì)IL-8表達(dá)的影響[J];毒理學(xué)雜志;2011年03期

6 何樹光;;肺炎支原體感染患兒IL-6、IL-8的臨床檢驗(yàn)結(jié)果分析[J];中國現(xiàn)代醫(yī)生;2011年16期

7 項(xiàng)明慧;;超聲造影技術(shù)在臨床上的應(yīng)用[J];沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2011年03期

8 莊華;楊志剛;;超聲造影時(shí)間強(qiáng)度曲線在腹腔臟器功能及腫瘤灌注成像定量研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2011年03期

9 陳錦芳;徐韶連;;慢性非特異性潰瘍性結(jié)腸炎濕熱內(nèi)蘊(yùn)證結(jié)腸黏膜病理免疫特點(diǎn)研究[J];光明中醫(yī);2011年10期

10 嚴(yán)張仁;王萬春;龔麗萍;諶莉媚;劉學(xué)偉;;涼血解毒透表法對(duì)尋常型銀屑病患者血清TNF-α和IL-8水平的影響[J];遼寧中醫(yī)雜志;2011年09期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 樊靜;李穎如;張家敏;蔣曉春;蘇金媚;章建全;;雙重超聲造影在膽道梗阻性疾病的應(yīng)用[A];第二屆長三角超聲醫(yī)學(xué)論壇暨2009年浙江省超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2009年

2 許萍;王怡;富麗娜;汪曉虹;;實(shí)時(shí)灰階超聲造影在乳腺導(dǎo)管原位癌診斷中的初步評(píng)價(jià)[A];第二屆長三角超聲醫(yī)學(xué)論壇暨2009年浙江省超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2009年

3 項(xiàng)東英;何文;寧彬;張紅霞;;肺癌超聲造影的臨床研究[A];中國超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)第七屆全國腹部超聲學(xué)術(shù)會(huì)議學(xué)術(shù)論文匯編[C];2007年

4 司芩;呂效平;穆紅艷;錢曉莉;仝威;黃聲稀;;脈沖反向諧波實(shí)時(shí)超聲造影對(duì)肝占位病變的臨床研究[A];中國超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)第七屆全國腹部超聲學(xué)術(shù)會(huì)議學(xué)術(shù)論文匯編[C];2007年

5 王文平;魏瑞雪;丁紅;黃備建;李超倫;毛楓;季正標(biāo);;復(fù)發(fā)性肝癌的超聲造影表現(xiàn)[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十次全國超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

6 鄭志強(qiáng);楊勇明;黃品同;黃福光;趙雅萍;游濤;俞耀軍;盧明東;趙智林;張毅;孫維建;胡經(jīng)緯;王奕庚;;雙重超聲造影在胃癌術(shù)前T分期中的價(jià)值[A];2007年浙江省腫瘤外科學(xué)術(shù)年會(huì)暨溫州醫(yī)學(xué)會(huì)腫瘤分會(huì)第四屆年會(huì)論文匯編[C];2007年

7 王莎莎;李葉闊;朱賢勝;程琦;賀東蓮;;超聲造影在顱內(nèi)腫瘤術(shù)中的臨床應(yīng)用[A];中國超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)第七屆全國腹部超聲學(xué)術(shù)會(huì)議學(xué)術(shù)論文匯編[C];2007年

8 李興升;王志剛;楊春江;張群霞;冉海濤;景香香;李攀;;一種載基因脂質(zhì)超聲造影劑的制備及特性的實(shí)驗(yàn)研究[A];中國超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)第七屆全國腹部超聲學(xué)術(shù)會(huì)議學(xué)術(shù)論文匯編[C];2007年

9 林禮務(wù);薛恩生;陳志奎;蔡敏嫻;俞麗云;;一種PLGA-PEG-PLGA共聚物微泡超聲造影劑的制備及其體內(nèi)外顯影研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十次全國超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

10 劉平;王翔;趙洋;高云華;;自制脂膜超聲造影劑安全性及與Sono Vue~汶對(duì)肝臟增強(qiáng)顯像異同性研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十次全國超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 通訊員　曾理　記者　馮競;新型超聲造影劑研制成功[N];科技日?qǐng)?bào);2007年

2 周翔;超聲造影：診斷腫瘤的新尖兵[N];家庭醫(yī)生報(bào);2007年

3 王雪飛;為臨床醫(yī)學(xué)研究加油[N];健康報(bào);2006年

4 本報(bào)記者　 劉云濤;加強(qiáng)自主創(chuàng)新轉(zhuǎn)變應(yīng)用重點(diǎn)[N];中國醫(yī)藥報(bào);2006年

5 吳祈耀 北京理工大學(xué)教授;高新技術(shù) 走勢(shì)看好[N];中國人口報(bào);2001年

6 通訊員 昌家杰 黃治才 寧習(xí)源 本報(bào)記者 于莘明;科研緊盯病人需求[N];科技日?qǐng)?bào);2005年

7 王立峰;國產(chǎn)造影劑市場(chǎng) 未動(dòng)的奶酪[N];中國高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報(bào);2003年

8 本報(bào)記者 丁琛;做強(qiáng)做大醫(yī)院藥學(xué)[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2003年

9 昌家杰 寧習(xí)源 記者 于莘明;南方醫(yī)院為地方建立不走的醫(yī)療隊(duì)[N];科技日?qǐng)?bào);2004年

10 召信;韶關(guān)創(chuàng)新基金加速企業(yè)成長[N];科技日?qǐng)?bào);2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 邢占文;新型微泡超聲造影劑的制備及性能與應(yīng)用的研究[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2010年

2 余進(jìn)洪;靶向納米脂質(zhì)超聲造影劑評(píng)價(jià)肝臟儲(chǔ)備功能的實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

3 李?yuàn)W;多功能超聲造影劑的制備及顯像實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2012年

4 高峰;超聲分子影像顯像胰島移植IBMIR[D];中南大學(xué);2010年

5 于銘;一種新型超聲造影劑JD-95介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子基因治療心肌缺血的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué);2003年

6 邱媛媛;超聲聯(lián)合微泡促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染的研究[D];南京大學(xué);2011年

7 尚芝群;IL-8對(duì)前列腺癌進(jìn)展作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2009年

8 董怡;超聲造影定量分析技術(shù)評(píng)價(jià)腎功能狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)和臨床研究[D];復(fù)旦大學(xué);2008年

9 楊陽;骨橋蛋白對(duì)人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞IL-6和IL-8表達(dá)的影響[D];中南大學(xué);2012年

10 郭盛磊;喜樹堿衍生物CZ48高分子載體系統(tǒng)的構(gòu)建及其性能研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 楊薇;攜IL-8單抗靶向超聲造影劑的制備及體外與血管內(nèi)皮細(xì)胞作用實(shí)驗(yàn)研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2012年

2 楊莉;新型超聲造影劑—全氟丙烷人血白蛋白微球注射劑的制備與藥物動(dòng)力學(xué)研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2002年

3 張艷;超聲造影診斷移植腎動(dòng)脈狹窄的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2007年

4 杜彩云;超聲造影劑—充氣白蛋白微球的制備及表征[D];延邊大學(xué);2008年

5 徐海珊;實(shí)時(shí)灰階超聲造影和增強(qiáng)螺旋CT診斷肝局灶性病變的比較研究[D];浙江大學(xué);2008年

6 胡云鳳;斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）IL-8基因cDNA的克隆及組成型表達(dá)分析[D];暨南大學(xué);2010年

7 徐磊;納米氧化鋅顆粒誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞IL-8基因表達(dá)的機(jī)制[D];鄭州大學(xué);2010年

8 徐韶連;慢性非特異性潰瘍性結(jié)腸炎濕熱內(nèi)蘊(yùn)證腸黏膜病理及TNF-a、IL-8分泌水平研究[D];福建中醫(yī)藥大學(xué);2010年

9 張亞萍;載血卟啉PLGA超聲造影劑的優(yōu)化制備及其治療小鼠肝癌移植瘤的實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2010年

10 武會(huì)敏;微鈦釘支抗負(fù)載前后周圍液體中IL-8及sICAM-1水平的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2011年

，

本文編號(hào)：2671702