【摘要】：背景 前列腺癌是男性高發(fā)的惡性腫瘤之一，常規(guī)去激素治療后多數(shù)會(huì)在12-18個(gè)月內(nèi)發(fā)展成為雄激素非依賴性前列腺癌（AIPC），目前臨床上對(duì)于AIPC缺乏有效的治療方法。雄激素受體（AR）在AIPC的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用，利用RNA干擾技術(shù)，阻斷雄激素受體的表達(dá)可以起到治療AIPC的作用并已經(jīng)在體外實(shí)驗(yàn)中取得良好的效果。但同其他腫瘤的基因治療一樣，前列腺癌臨床或體內(nèi)基因治療效果不盡理想，存在基因轉(zhuǎn)染率低，治療基因難以聚集到靶組織內(nèi)等問題，其主要原因是缺乏一種安全、可控、靶向的基因遞送載體。超聲微泡的出現(xiàn)為解決基因治療這一瓶頸問題帶來了希望，超聲微泡介導(dǎo)的靶向基因治療方法既可增強(qiáng)基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)染和表達(dá)情況,又能提高基因治療的靶向性,減少全身不良反應(yīng)，與其它方法相比，具有安全、有效、靶向性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是一種很有前景的臨床腫瘤治療技術(shù)。隨著納米醫(yī)學(xué)和超聲造影劑的飛速發(fā)展，納米級(jí)超聲微泡成為超聲造影劑的發(fā)展趨勢(shì)。與常規(guī)微米級(jí)微泡相比，納米級(jí)微泡具有較強(qiáng)的穿透力，穩(wěn)定性高，包載率及攜載基因轉(zhuǎn)染效率高等特點(diǎn)，在腫瘤的基因治療和靶向顯影方面逐步體現(xiàn)出其巨大的優(yōu)勢(shì)。 研究目的 基于以上研究進(jìn)展，本研究擬在篩選出最有效的AR siRNA序列基礎(chǔ)之上，利用納米級(jí)超聲微泡作為基因遞送載體，制備攜載AR siRNA的納米級(jí)超聲微泡，檢測(cè)其體內(nèi)外特性，并在超聲輻照下轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞。在細(xì)胞分子生物學(xué)水平評(píng)價(jià)攜載AR siRNA納米級(jí)微泡抑制AR基因的表達(dá)及前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的效果。為超聲輻照下納米級(jí)微泡作為體內(nèi)基因載體治療AIPC腫瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和研究基礎(chǔ)。 方法 1．設(shè)計(jì)并合成三種靶向于雄激素受體的siRNA，利用當(dāng)今廣泛應(yīng)用的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，以不同濃度轉(zhuǎn)染AIPC細(xì)胞C4-2，確定最佳轉(zhuǎn)染濃度。RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后AR mRNA表達(dá)水平和AR蛋白表達(dá)水平。CCK-8分析繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，觀察C4-2細(xì)胞生長(zhǎng)活性并篩選出抑制效果最佳的siRNA靶序列。 2．通過機(jī)械振蕩及低速離心法制備空白納米級(jí)微泡，利用多聚賴氨酸法制備攜載AR siRNA的納米級(jí)超聲微泡，檢測(cè)兩者微泡粒徑，表面電位及微泡與siRNA結(jié)合情況。在裸鼠前列腺癌移植瘤進(jìn)行造影顯像研究，并與常規(guī)微米級(jí)微泡（SonoVue）對(duì)比造影效果。 3．超聲輻照下攜載AR siRNA的納米級(jí)超聲微泡轉(zhuǎn)染LNCap、C4-2和PC-3三種前列腺癌細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測(cè)定轉(zhuǎn)染率，篩選最佳超聲輻照條件和微泡濃度范圍。RT-PCR和Weston blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后AR mRNA和AR蛋白表達(dá)水平，CCK-8分析繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，評(píng)價(jià)AR siRNA沉默靶基因?qū)η傲邢侔┘?xì)胞生長(zhǎng)的抑制效果。 結(jié)果 1．以100nM最佳轉(zhuǎn)染濃度轉(zhuǎn)染C4-2細(xì)胞后，AR的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下降，細(xì)胞增殖活性顯著降低，并根據(jù)抑制效果篩選出最有效靶序列。 2．熒光顯微鏡下觀察納米級(jí)微泡與AR siRNA緊密結(jié)合，并可以通過提高ARsiRNA濃度來增加載基因量。粒徑檢測(cè)儀測(cè)量平均粒徑（608.2±13.3）nm，，Zeta電位（-29.9±6.5）mV。與“SonoVue”比較，納米級(jí)微泡體內(nèi)顯影時(shí)間較前者顯著延長(zhǎng)（P0.05），腫瘤中心乏血管區(qū)域顯影效果較好。 3．超聲輻照下攜載AR siRNA的納米級(jí)微泡轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞，獲得最高細(xì)胞轉(zhuǎn)染率的體外超聲輻照條件為MI=1.2，輻照時(shí)長(zhǎng)=2min，微泡量/細(xì)胞量=100:1（載基因量18.94×10-9nmol/個(gè)）。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)光鏡觀察C4-2和LNCap細(xì)胞的裸ARsiRNA+超聲輻照組、裸ARsiRNA+空白納米級(jí)微泡+超聲輻照組和攜載ARsiRNA的納米級(jí)微泡+超聲輻照組均出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)變化，以48小時(shí)變化明顯，主要表現(xiàn)為細(xì)胞輪廓模糊，形態(tài)萎縮，生長(zhǎng)緩慢，而PC-3細(xì)胞形態(tài)變化不明顯。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示：上述三組C4-2和LNCap細(xì)胞的AR mRNA和AR蛋白表達(dá)分別受到不同程度的抑制，其中攜載ARsiNA的納米級(jí)微泡+超聲輻照組的抑制作用最為明顯。CCK8分析結(jié)果顯示：C4-2和LNCap細(xì)胞的上述三組siRNA轉(zhuǎn)染C4-2細(xì)胞后均可以達(dá)到較明顯的生長(zhǎng)抑制效果，其中C4-2細(xì)胞的攜ARsiRNA納米級(jí)微泡+超聲輻照組的生長(zhǎng)抑制率最高，為64.7%，與其余各組或PC-3轉(zhuǎn)染各組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 結(jié)論 1.利用RNAi技術(shù)沉默AR基因，能夠抑制前列腺癌C4-2細(xì)胞的生長(zhǎng)活性。 2.利用多聚賴氨酸法制備的攜載AR siRNA的納米級(jí)微泡，微泡與siRNA結(jié)合較為牢固，載基因量高。在體內(nèi)外特性的檢測(cè)中，納米級(jí)微泡在穩(wěn)定性及成像特性方面優(yōu)于微米級(jí)微泡。 3.利用納米級(jí)微泡作為載體，在超聲輻照下將AR siRNA轉(zhuǎn)染至前列腺癌細(xì)胞，可以有效的沉默AR基因，抑制LNCap、C4-2前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。
【圖文】：

M:分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:AR siRNAⅠ;2:AR siRNAⅡ;3:AR siRNAⅢ;4:siRNA-NC圖 1-1 合成的 AR siRNA 2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果轉(zhuǎn)染組 陰性對(duì)照組圖 1-2：AR siRNA 轉(zhuǎn)染 C4-2 后細(xì)胞形態(tài)變化（200×）

20轉(zhuǎn)染組 陰性對(duì)照組圖 1-2：AR siRNA 轉(zhuǎn)染 C4-2 后細(xì)胞形態(tài)變化（200×）子量標(biāo)準(zhǔn);1:AR siRNA I;2:AR siRNA Ⅱ;3:AR siRNA Ⅲ;4:陰性對(duì)照;5:空白對(duì)照;6:無(wú)關(guān)圖 1-3 RT-PCR 檢測(cè) siRNA 轉(zhuǎn)染后 AR mRNA 表達(dá)水平
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R445.1;R737.25

【參考文獻(xiàn)】

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