【摘要】： 第一部分 血管內(nèi)皮生長因子緩釋明膠微球制備及性能評價 目的:制備血管內(nèi)皮生長因子明膠微球并評價其緩釋性能。方法:以乳化冷凝法制備VEGF緩釋明膠微球。20%的明膠溶液滴加于橄欖油中攪拌至形成乳濁液,丙酮固化,異丙醇懸浮后以不同孔徑篩網(wǎng)篩分。離心干燥后,戊二醛交聯(lián),清洗后冷凍干燥,得淡黃色明膠微球。鈷60照射滅菌。將微球浸泡于磷酸鹽緩沖液中24小時,微球充分溶脹后,以顯微鏡自帶軟件測量微球粒徑。取滅菌凍干明膠微球9 mg,平均分成3組,將1.5μCi~(125)Ⅰ-VEGF溶于30μl PBS中,平均滴加于3組明膠微球,4℃過夜。PBS離心洗滌2次。將微球重懸于2ml PBS中,于Γ-計數(shù)器檢測總放射性強度。之后將重懸的微球置于37℃恒溫搖床中,每24 h全量更換溶出液。以Γ-計數(shù)器檢測各時點微球中的剩余放射性強度,繪制釋放曲線。昆明小鼠42只,隨機分為14組,每組3只。取明膠微球凍干粉126 mg,平均分為42份,將21μCi~(125)Ⅰ-VEGF溶于420μl PBS中,平均滴加于每份明膠微球,4℃過夜。將每份微球重懸于100μl PBS中,注射于小鼠左后肢皮下組織中。每24 h處死一組小鼠,剪取左下肢,以Γ-計數(shù)器檢測組織中的剩余放射性強度。以每組放射性強度的平均值繪制~(125)Ⅰ-VEGF釋放曲線。 結(jié)果:溶脹后的明膠微球平均粒徑為(202.0±44.7)μm。微球體外緩釋性能測試實驗中,明膠微球在前4天釋放VEGF速度較快,在第96小時,已由微球釋放于溶出液中的VEGF的累積量占微球中初始VEGF總含量的48.73%。之后釋放速度漸減慢,于第144小時微球中~(125)Ⅰ-VEGF的剩余量為初始量的46.98%。此后微球中VEGF的剩余量達到平臺期。微球體內(nèi)緩釋性能測試實驗中,微球中~(125)Ⅰ-VEGF剩余量占初始總含量的百分比呈逐漸下降的趨勢。在第96小時,小鼠后肢~(125)Ⅰ-VEGF的剩余量為51.9%,于第144小時,小鼠后肢~(125)Ⅰ-VEGF的剩余量為41.89%,在第288小時,~(125)Ⅰ-VEGF的剩余量為9.98%。 結(jié)論:明膠微球包載VEGF后能夠?qū)崿F(xiàn)VEGF的緩慢釋放。血管內(nèi)皮生長因子緩釋微球?qū)θ毖孕呐K病治療作用的實驗研究 目的:探討血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)緩釋明膠微球能否誘導缺血心肌血管新生。 方法:以乳化冷凝法制備VEGF緩釋明膠微球,并以1,1'-雙十八烷-3,3,3',3'-四甲基-吲哚-羧花青-高氯酸鹽(DiI)熒光標記。中華小型豬18頭,按照隨機化表將動物分為VEGF緩釋微球移植組、空載微球移植組及對照組。開胸結(jié)扎冠狀動脈左前降支制備小型豬心梗模型。心肌梗死模型建立后14 d磁共振檢查后行二次開胸,暴露左室前壁近心尖部,于VEGF緩釋微球移植組動物梗死周邊區(qū)心肌注射包載VEGF的緩釋微球,每只動物注射3點,每點注射量3 mg(含VEGF 3μg);于空載微球組梗死周邊區(qū)心肌注射等量未包裹VEGF的緩釋微球,每只動物注射3個點。對照組注射含等量VEGF的磷酸鹽緩沖液。微球移植后24 h(基線)及21 d(終點),電影MRI和增強MRI采集動物心功能參數(shù)并測量心梗面積。終點指標檢測結(jié)束后處死動物進行組織學檢測,免疫組化法檢測微球移植局部缺血心肌的纖維化程度、毛細血管密度及微球降解情況。 結(jié)果小型豬左前降支結(jié)扎后第14天,延遲增強磁共振成像顯示左室前壁、心尖部及室間隔均有延遲增強灶。在微球移植后24h及與移植后21d,各組間心肌梗死面積及心功能參數(shù)均無統(tǒng)計學差異。組織學結(jié)果提示在微球移植于缺血心肌3周后,VEGF緩釋微球移植組微球移植點處心肌組織纖維化程度低于空載微球移植組及對照組。VEGF緩釋微球移植組微球注射點處心肌毛細血管密度高于空載微球移植組及對照組(9.8±1.5/HPF vs 4.1±0.9 and 3.7±1.1/HPF,P0.05)。明膠微球移植于缺血心肌3周后,組織間隙中可見明膠微球降解碎片。 結(jié)論血管內(nèi)皮生長因子緩釋明膠微球能夠誘導缺血心肌區(qū)新生血管形成。細胞因子緩釋微球加強骨髓間充質(zhì)干細胞移植對心肌梗死療效的研究 目的本研究通過觀察血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)緩釋明膠微球與自體骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)聯(lián)合移植于豬心肌梗死模型梗死周邊區(qū)3周后MSCs的生存情況,結(jié)合磁共振成像(magneticresonance imaging,MRI),闡明改善局部微環(huán)境對自體MSCs移植于缺血心肌后轉(zhuǎn)歸的影響。 方法以乳化冷凝法制備VEGF緩釋明膠微球。中華小型豬18頭。抽取髂骨骨髓并制備自體MSCs,以注射用順磁性氧化鐵顆粒(superparamagnetic iron oxide particles,SPIO)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride,DAPI)標記細胞并進行標記率檢測。按照隨機化表將動物分為對照組、MSCs移植組(MSCs組)及MSCs-VEGF緩釋微球聯(lián)合移植組(MSCs-VEGF組)。開胸結(jié)扎冠狀動脈左前降支制備小型豬心肌梗死模型。模型建立后第14天,磁共振延遲增強成像(delatedenhancement MRI,DE-MRI)檢測梗死面積后行二次開胸,直視經(jīng)心外膜于MSCs組動物心肌梗死周邊區(qū)注射MSCs 3個點(3×10~7/點),于MSCs-VEGF緩釋微球組每只動物注射3個點,每點注射MSCs 3×10~7及VEGF緩釋明膠微球3mg(含人重組VEGF165 3μg),于對照組動物心梗周邊區(qū)相應(yīng)部位注射培養(yǎng)基DMEM。微球移植后24 h(基線)及21 d(終點),電影MRI和增強MRI采集動物心功能參數(shù)包括射血分數(shù)、左室舒張末期容積、左室收縮末期容積、左室前壁室壁增厚率,并測量心梗面積。終點指標檢測結(jié)束后處死動物進行組織學檢測,免疫組化法檢測微球移植局部缺血心肌的纖維化程度、毛細血管密度及干細胞存活情況。 結(jié)果DAPI對MSCs的標記率達100%。心梗模型建立后第14天,小型豬心肌梗死面積為33.6%±8.9%。細胞移植后24 h,三組間心梗面積及心功能參數(shù)均無統(tǒng)計學差異。細胞移植3周后,MSCs組及MSCs-VEGF組左室前壁室壁增厚率高于對照組(-5.23±3.82和-1.52±4.81比-15.53±3.42,P0.05),MSCs-VEGF組左室收縮末期容積小于對照組(31.20±3.56 vs 37.05±6.26,P0.05)。MSCs-VEGF組細胞注射點心肌毛細血管密度高于MSCs組及對照組(18.18±6.6比10±3.58和12.81±4.26/HPF;P0:05)。MSCs-VEGF緩釋微球組MSCs注射點存活的移植干細胞數(shù)多于MSCs組(383.07±96.33/高倍視野比285.17±73.97/高倍視野,P0.0001),而MSCs凋亡率則低于MSCs組5.24±5.44%vs 10.24±5.04%,P0.05]。 結(jié)論VEGF緩釋明膠微球可以提高移植于缺血心肌區(qū)3周MSCs的生存率。移植干細胞所生存的微環(huán)境是影響其轉(zhuǎn)歸的重要因素。磁共振在體示蹤氧化鐵納米顆粒標記移植干細胞的量化分析及可靠性評價 目的通過觀察移植于豬心肌梗死模型梗死周邊區(qū)及正常心肌區(qū)順磁性氧化鐵顆粒標記的自體骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)所形成低信號區(qū)的信號變化情況,結(jié)合組織學檢查結(jié)果,評價MRI對干細胞移植于缺血心肌后數(shù)量演變的監(jiān)測價值。 方法中華小型豬6頭,抽取髂骨骨髓并制備自體骨髓間質(zhì)干細胞,以注射用順磁性氧化鐵顆粒(superparamagnetic iron oxide particles,SPIO)和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride,DAPI)標記細胞并進行標記率檢測。開胸結(jié)扎冠狀動脈左前降支制備小型豬心肌梗死模型。模型建立后14 d,行二次開胸,直視經(jīng)心外膜于每只動物心肌梗死周邊區(qū)和正常心肌區(qū)各注射標記MSCs 2個點,每點注射MSCs 3×10~7。同時分別于各區(qū)注射培養(yǎng)基2個點作為對照點。細胞移植后24 h及21 d,快速梯度回波序列(FGRE序列)T_2~*像檢測干細胞移植點低信號區(qū)的面積及信號強度。T_2~*信號減低區(qū)范圍的測量由FGRE面積法實現(xiàn),其信號減低的程度以正常心肌區(qū)和該區(qū)的T_2~*值之差與正常心肌區(qū)T_2~*值的百分比表示。病理組織學檢查心肌細胞形態(tài)、瘢痕形成、毛細血管密度及干細胞存活情況。不同時點MSCs注射點低信號區(qū)面積及T_2~*信號強度的比較采用重復測量方差分析及配對t檢驗。干細胞注射點與對照點毛細血管密度的比較、梗死周邊區(qū)及正常心肌區(qū)MSCs注射點信號衰減幅度的比較采用成組資料t檢驗。 結(jié)果DAPI及SPIO對MSCs的標記率均達100%。細胞移植后24 h,SPIO標記MSCs注射點于MRI顯示為邊界清晰的卵圓形T_2~*低信號區(qū),MSCs注射后24 h,梗死周邊區(qū)與正常心肌區(qū)MSCs注射點T_2~*低信號區(qū)的信號強度[(67±5.48)%vs(61.92±7.76)%t=1.65 P=0.1158)]及面積[(0.56±0.24)cm~2 vs(0.52±0.25)cm~2,t=0.39,P=0.7044)]均無統(tǒng)計學差異。移植3周后,T_2~*低信號區(qū)與正常心肌區(qū)的對比程度均較前下降,梗死周邊區(qū)降低至(40.12±5.93)%(t=9.53,P0.0001);正常心肌區(qū)降低至(46.92±6.25)%(t=11.03,P0.0001)。且梗死周邊區(qū)MSCs注射點低信號區(qū)T_2~*減低的程度大于正常心肌區(qū)MSCs注射點且兩組間信號強度減弱的幅度具有顯著性差異(26.88±7.27 vs 15±4.51,F=20.08,P=0.0003),此時梗死周邊區(qū)MSCs注射點T_2~*低信號區(qū)的信號對比度低于正常心肌區(qū)MSCs注射點(t=-2.48,P=0.0234)。同時,T_2~*低信號區(qū)的面積亦均較前降小,但低信號區(qū)面積減小的程度在梗死周邊區(qū)及正常心肌區(qū)無顯著性差異(F=1.15,P=0.2982)。正常心肌區(qū)MSCs注射點組織中熒光標記的細胞核分布密度高于梗死邊緣區(qū)MSCs注射點(106±25/HPF vs143±31/HPF,t=-2.47,P=0.0293)。梗死邊緣區(qū)MSCs注射點組織中毛細血管分布密度高于該區(qū)對照點(13.4±4.0/HPF vs 9.4±3.1/HPF,t=2.49,P=0.0229)。 結(jié)論MRI可在一定時間內(nèi)實現(xiàn)對移植干細胞的示蹤并反映移植MSCs在心肌局部的數(shù)量變化趨勢。移植干細胞所生存的微環(huán)境是影響其生存時間的重要因素。氧化鐵顆粒標記的間充質(zhì)干細胞排除鐵顆粒機制的初步探討 目的本研究從細胞學實驗的角度探討在間充質(zhì)干細胞分裂增殖過程中標記于干細胞胞漿中的超順磁性氧化鐵顆粒(superparamagnetic iron oxide,SPIO)標記率的演變,以明確干細胞分裂增殖對SPIO標記率變化的影響。 方法抽取豬髂骨骨髓,密度梯度離心后獲取單個核細胞層,以差時貼壁的方法純化培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)。第一代細胞達到80%融合時,以1:3比例接種于兩組六孔板中。以含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)。在細胞達60-70%融合時,換以含鐵25 ng/L及多聚賴氨酸375 pg/L的培養(yǎng)基為細胞換液,并培養(yǎng)細胞48 h。之后,細胞達到80%融合。將另一六孔板中的細胞以1:3比例傳代至新的3塊六孔板中,其中兩塊板的六個孔底部放置滅菌蓋玻片。其中一組細胞換以含15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng),而另一組細胞換以含5%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)。每隔24小時取出相應(yīng)組別的細胞爬片進行固定、染色、檢測。其余細胞分別以兩種不同的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)傳代。將制備好的細胞爬片進行普魯士藍染色并估測細胞氧化鐵顆粒標記率。 結(jié)果:SPIO標記干細胞48小時后,細胞爬片普魯士藍染色可見所有細胞中均含有藍染顆粒,位于細胞核周圍。將SPIO標記的細胞以不同條件的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),兩組細胞SPIO標記率均逐漸減低,細胞中鐵顆粒的量逐漸減少。以含15%胎牛血清的高糖DMEM繼續(xù)培養(yǎng)的細胞組,標記后72小時細胞達到80%融合,進行第一次傳代,傳代后24小時,SPIO標記率較前略有降低(98±4.39)%(P=0.0409),培養(yǎng)72小時后,第二次傳代,傳代后24小時,細胞SPIO標記率降低為(88.67±3.93)%,與第一次傳代后相比有統(tǒng)計學差異(P=0.0004)。繼續(xù)培養(yǎng)72小時后,第三次傳代,傳代后24小時可見SPIO標記率進一步降低至(44.5±7.74)%,與第二次傳代后24小時相比有統(tǒng)計學差異(P0.0001)。第四次傳代后24小時,SPIO標記率為(6.17±2.64)%。以含5%FBS的低糖DMEM繼續(xù)培養(yǎng)的細胞組,標記后96小時細胞達到80%融合,進行第一次傳代,傳代后24小時,SPIO標記率較前略有降低(97±0.86)%(P=0.0172),培養(yǎng)120小時后,第二次傳代,傳代后24小時,細胞SPIO標記率降低為(87±4.29)%,與第一次傳代后相比有統(tǒng)計學差異(P=0.0004)。繼續(xù)培養(yǎng)144小時后,第三次傳代,傳代后24小時可見SPIO標記率進一步降低至(46.7±7.06)%,與第二次傳代后24小時相比有統(tǒng)計學差異(P0.0001)。第四次傳代后24小時,SPIO標記率為第四次傳代后24小時,SPIO標記率為(5.17±3.06)%。在兩組細胞,均在標記以后第四次傳代后24小時,SPIO的標記率下降至10%以下,在高糖DMEM組歷時9天,而在低糖DMEM組歷時16天。在標記后第四次傳代后24小時,兩組細胞SPIO標記率無統(tǒng)計學差異[(5.17±3.06)%比(6.17±2.64)%,P=0.558]。 結(jié)論SPIO標記的間充質(zhì)干細胞排除SPIO的機制主要為細胞的分裂增殖。細胞分裂增殖越快,細胞清除SPIO的速率也越快。
【圖文】：

光鏡下的明膠微球

明膠微球于體外前3天釋放VEGF速度較快，，之后釋放速度漸減慢，約第10天后達到平臺期
【學位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R542.22;R445.2

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