發(fā)布時間：2020-05-14 10:53

【摘要】： 第一部分 血管內(nèi)皮生長因子緩釋明膠微球制備及性能評價(jià) 目的:制備血管內(nèi)皮生長因子明膠微球并評價(jià)其緩釋性能。方法:以乳化冷凝法制備VEGF緩釋明膠微球。20%的明膠溶液滴加于橄欖油中攪拌至形成乳濁液,丙酮固化,異丙醇懸浮后以不同孔徑篩網(wǎng)篩分。離心干燥后,戊二醛交聯(lián),清洗后冷凍干燥,得淡黃色明膠微球。鈷60照射滅菌。將微球浸泡于磷酸鹽緩沖液中24小時,微球充分溶脹后,以顯微鏡自帶軟件測量微球粒徑。取滅菌凍干明膠微球9 mg,平均分成3組,將1.5μCi~(125)Ⅰ-VEGF溶于30μl PBS中,平均滴加于3組明膠微球,4℃過夜。PBS離心洗滌2次。將微球重懸于2ml PBS中,于Γ-計(jì)數(shù)器檢測總放射性強(qiáng)度。之后將重懸的微球置于37℃恒溫?fù)u床中,每24 h全量更換溶出液。以Γ-計(jì)數(shù)器檢測各時點(diǎn)微球中的剩余放射性強(qiáng)度,繪制釋放曲線。昆明小鼠42只,隨機(jī)分為14組,每組3只。取明膠微球凍干粉126 mg,平均分為42份,將21μCi~(125)Ⅰ-VEGF溶于420μl PBS中,平均滴加于每份明膠微球,4℃過夜。將每份微球重懸于100μl PBS中,注射于小鼠左后肢皮下組織中。每24 h處死一組小鼠,剪取左下肢,以Γ-計(jì)數(shù)器檢測組織中的剩余放射性強(qiáng)度。以每組放射性強(qiáng)度的平均值繪制~(125)Ⅰ-VEGF釋放曲線。 結(jié)果:溶脹后的明膠微球平均粒徑為(202.0±44.7)μm。微球體外緩釋性能測試實(shí)驗(yàn)中,明膠微球在前4天釋放VEGF速度較快,在第96小時,已由微球釋放于溶出液中的VEGF的累積量占微球中初始VEGF總含量的48.73%。之后釋放速度漸減慢,于第144小時微球中~(125)Ⅰ-VEGF的剩余量為初始量的46.98%。此后微球中VEGF的剩余量達(dá)到平臺期。微球體內(nèi)緩釋性能測試實(shí)驗(yàn)中,微球中~(125)Ⅰ-VEGF剩余量占初始總含量的百分比呈逐漸下降的趨勢。在第96小時,小鼠后肢~(125)Ⅰ-VEGF的剩余量為51.9%,于第144小時,小鼠后肢~(125)Ⅰ-VEGF的剩余量為41.89%,在第288小時,~(125)Ⅰ-VEGF的剩余量為9.98%。 結(jié)論:明膠微球包載VEGF后能夠?qū)崿F(xiàn)VEGF的緩慢釋放。血管內(nèi)皮生長因子緩釋微球?qū)θ毖孕呐K病治療作用的實(shí)驗(yàn)研究 目的:探討血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)緩釋明膠微球能否誘導(dǎo)缺血心肌血管新生。 方法:以乳化冷凝法制備VEGF緩釋明膠微球,并以1,1'-雙十八烷-3,3,3',3'-四甲基-吲哚-羧花青-高氯酸鹽(DiI)熒光標(biāo)記。中華小型豬18頭,按照隨機(jī)化表將動物分為VEGF緩釋微球移植組、空載微球移植組及對照組。開胸結(jié)扎冠狀動脈左前降支制備小型豬心梗模型。心肌梗死模型建立后14 d磁共振檢查后行二次開胸,暴露左室前壁近心尖部,于VEGF緩釋微球移植組動物梗死周邊區(qū)心肌注射包載VEGF的緩釋微球,每只動物注射3點(diǎn),每點(diǎn)注射量3 mg(含VEGF 3μg);于空載微球組梗死周邊區(qū)心肌注射等量未包裹VEGF的緩釋微球,每只動物注射3個點(diǎn)。對照組注射含等量VEGF的磷酸鹽緩沖液。微球移植后24 h(基線)及21 d(終點(diǎn)),電影MRI和增強(qiáng)MRI采集動物心功能參數(shù)并測量心梗面積。終點(diǎn)指標(biāo)檢測結(jié)束后處死動物進(jìn)行組織學(xué)檢測,免疫組化法檢測微球移植局部缺血心肌的纖維化程度、毛細(xì)血管密度及微球降解情況。 結(jié)果小型豬左前降支結(jié)扎后第14天,延遲增強(qiáng)磁共振成像顯示左室前壁、心尖部及室間隔均有延遲增強(qiáng)灶。在微球移植后24h及與移植后21d,各組間心肌梗死面積及心功能參數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。組織學(xué)結(jié)果提示在微球移植于缺血心肌3周后,VEGF緩釋微球移植組微球移植點(diǎn)處心肌組織纖維化程度低于空載微球移植組及對照組。VEGF緩釋微球移植組微球注射點(diǎn)處心肌毛細(xì)血管密度高于空載微球移植組及對照組(9.8±1.5/HPF vs 4.1±0.9 and 3.7±1.1/HPF,P0.05)。明膠微球移植于缺血心肌3周后,組織間隙中可見明膠微球降解碎片。 結(jié)論血管內(nèi)皮生長因子緩釋明膠微球能夠誘導(dǎo)缺血心肌區(qū)新生血管形成。細(xì)胞因子緩釋微球加強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對心肌梗死療效的研究 目的本研究通過觀察血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)緩釋明膠微球與自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)聯(lián)合移植于豬心肌梗死模型梗死周邊區(qū)3周后MSCs的生存情況,結(jié)合磁共振成像(magneticresonance imaging,MRI),闡明改善局部微環(huán)境對自體MSCs移植于缺血心肌后轉(zhuǎn)歸的影響。 方法以乳化冷凝法制備VEGF緩釋明膠微球。中華小型豬18頭。抽取髂骨骨髓并制備自體MSCs,以注射用順磁性氧化鐵顆粒(superparamagnetic iron oxide particles,SPIO)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride,DAPI)標(biāo)記細(xì)胞并進(jìn)行標(biāo)記率檢測。按照隨機(jī)化表將動物分為對照組、MSCs移植組(MSCs組)及MSCs-VEGF緩釋微球聯(lián)合移植組(MSCs-VEGF組)。開胸結(jié)扎冠狀動脈左前降支制備小型豬心肌梗死模型。模型建立后第14天,磁共振延遲增強(qiáng)成像(delatedenhancement MRI,DE-MRI)檢測梗死面積后行二次開胸,直視經(jīng)心外膜于MSCs組動物心肌梗死周邊區(qū)注射MSCs 3個點(diǎn)(3×10~7/點(diǎn)),于MSCs-VEGF緩釋微球組每只動物注射3個點(diǎn),每點(diǎn)注射MSCs 3×10~7及VEGF緩釋明膠微球3mg(含人重組VEGF165 3μg),于對照組動物心梗周邊區(qū)相應(yīng)部位注射培養(yǎng)基DMEM。微球移植后24 h(基線)及21 d(終點(diǎn)),電影MRI和增強(qiáng)MRI采集動物心功能參數(shù)包括射血分?jǐn)?shù)、左室舒張末期容積、左室收縮末期容積、左室前壁室壁增厚率,并測量心梗面積。終點(diǎn)指標(biāo)檢測結(jié)束后處死動物進(jìn)行組織學(xué)檢測,免疫組化法檢測微球移植局部缺血心肌的纖維化程度、毛細(xì)血管密度及干細(xì)胞存活情況。 結(jié)果DAPI對MSCs的標(biāo)記率達(dá)100%。心梗模型建立后第14天,小型豬心肌梗死面積為33.6%±8.9%。細(xì)胞移植后24 h,三組間心梗面積及心功能參數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。細(xì)胞移植3周后,MSCs組及MSCs-VEGF組左室前壁室壁增厚率高于對照組(-5.23±3.82和-1.52±4.81比-15.53±3.42,P0.05),MSCs-VEGF組左室收縮末期容積小于對照組(31.20±3.56 vs 37.05±6.26,P0.05)。MSCs-VEGF組細(xì)胞注射點(diǎn)心肌毛細(xì)血管密度高于MSCs組及對照組(18.18±6.6比10±3.58和12.81±4.26/HPF;P0:05)。MSCs-VEGF緩釋微球組MSCs注射點(diǎn)存活的移植干細(xì)胞數(shù)多于MSCs組(383.07±96.33/高倍視野比285.17±73.97/高倍視野,P0.0001),而MSCs凋亡率則低于MSCs組5.24±5.44%vs 10.24±5.04%,P0.05]。 結(jié)論VEGF緩釋明膠微球可以提高移植于缺血心肌區(qū)3周MSCs的生存率。移植干細(xì)胞所生存的微環(huán)境是影響其轉(zhuǎn)歸的重要因素。磁共振在體示蹤氧化鐵納米顆粒標(biāo)記移植干細(xì)胞的量化分析及可靠性評價(jià) 目的通過觀察移植于豬心肌梗死模型梗死周邊區(qū)及正常心肌區(qū)順磁性氧化鐵顆粒標(biāo)記的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)所形成低信號區(qū)的信號變化情況,結(jié)合組織學(xué)檢查結(jié)果,評價(jià)MRI對干細(xì)胞移植于缺血心肌后數(shù)量演變的監(jiān)測價(jià)值。 方法中華小型豬6頭,抽取髂骨骨髓并制備自體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞,以注射用順磁性氧化鐵顆粒(superparamagnetic iron oxide particles,SPIO)和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride,DAPI)標(biāo)記細(xì)胞并進(jìn)行標(biāo)記率檢測。開胸結(jié)扎冠狀動脈左前降支制備小型豬心肌梗死模型。模型建立后14 d,行二次開胸,直視經(jīng)心外膜于每只動物心肌梗死周邊區(qū)和正常心肌區(qū)各注射標(biāo)記MSCs 2個點(diǎn),每點(diǎn)注射MSCs 3×10~7。同時分別于各區(qū)注射培養(yǎng)基2個點(diǎn)作為對照點(diǎn)。細(xì)胞移植后24 h及21 d,快速梯度回波序列(FGRE序列)T_2~*像檢測干細(xì)胞移植點(diǎn)低信號區(qū)的面積及信號強(qiáng)度。T_2~*信號減低區(qū)范圍的測量由FGRE面積法實(shí)現(xiàn),其信號減低的程度以正常心肌區(qū)和該區(qū)的T_2~*值之差與正常心肌區(qū)T_2~*值的百分比表示。病理組織學(xué)檢查心肌細(xì)胞形態(tài)、瘢痕形成、毛細(xì)血管密度及干細(xì)胞存活情況。不同時點(diǎn)MSCs注射點(diǎn)低信號區(qū)面積及T_2~*信號強(qiáng)度的比較采用重復(fù)測量方差分析及配對t檢驗(yàn)。干細(xì)胞注射點(diǎn)與對照點(diǎn)毛細(xì)血管密度的比較、梗死周邊區(qū)及正常心肌區(qū)MSCs注射點(diǎn)信號衰減幅度的比較采用成組資料t檢驗(yàn)。 結(jié)果DAPI及SPIO對MSCs的標(biāo)記率均達(dá)100%。細(xì)胞移植后24 h,SPIO標(biāo)記MSCs注射點(diǎn)于MRI顯示為邊界清晰的卵圓形T_2~*低信號區(qū),MSCs注射后24 h,梗死周邊區(qū)與正常心肌區(qū)MSCs注射點(diǎn)T_2~*低信號區(qū)的信號強(qiáng)度[(67±5.48)%vs(61.92±7.76)%t=1.65 P=0.1158)]及面積[(0.56±0.24)cm~2 vs(0.52±0.25)cm~2,t=0.39,P=0.7044)]均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。移植3周后,T_2~*低信號區(qū)與正常心肌區(qū)的對比程度均較前下降,梗死周邊區(qū)降低至(40.12±5.93)%(t=9.53,P0.0001);正常心肌區(qū)降低至(46.92±6.25)%(t=11.03,P0.0001)。且梗死周邊區(qū)MSCs注射點(diǎn)低信號區(qū)T_2~*減低的程度大于正常心肌區(qū)MSCs注射點(diǎn)且兩組間信號強(qiáng)度減弱的幅度具有顯著性差異(26.88±7.27 vs 15±4.51,F=20.08,P=0.0003),此時梗死周邊區(qū)MSCs注射點(diǎn)T_2~*低信號區(qū)的信號對比度低于正常心肌區(qū)MSCs注射點(diǎn)(t=-2.48,P=0.0234)。同時,T_2~*低信號區(qū)的面積亦均較前降小,但低信號區(qū)面積減小的程度在梗死周邊區(qū)及正常心肌區(qū)無顯著性差異(F=1.15,P=0.2982)。正常心肌區(qū)MSCs注射點(diǎn)組織中熒光標(biāo)記的細(xì)胞核分布密度高于梗死邊緣區(qū)MSCs注射點(diǎn)(106±25/HPF vs143±31/HPF,t=-2.47,P=0.0293)。梗死邊緣區(qū)MSCs注射點(diǎn)組織中毛細(xì)血管分布密度高于該區(qū)對照點(diǎn)(13.4±4.0/HPF vs 9.4±3.1/HPF,t=2.49,P=0.0229)。 結(jié)論MRI可在一定時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對移植干細(xì)胞的示蹤并反映移植MSCs在心肌局部的數(shù)量變化趨勢。移植干細(xì)胞所生存的微環(huán)境是影響其生存時間的重要因素。氧化鐵顆粒標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞排除鐵顆粒機(jī)制的初步探討 目的本研究從細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的角度探討在間充質(zhì)干細(xì)胞分裂增殖過程中標(biāo)記于干細(xì)胞胞漿中的超順磁性氧化鐵顆粒(superparamagnetic iron oxide,SPIO)標(biāo)記率的演變,以明確干細(xì)胞分裂增殖對SPIO標(biāo)記率變化的影響。 方法抽取豬髂骨骨髓,密度梯度離心后獲取單個核細(xì)胞層,以差時貼壁的方法純化培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。第一代細(xì)胞達(dá)到80%融合時,以1:3比例接種于兩組六孔板中。以含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)。在細(xì)胞達(dá)60-70%融合時,換以含鐵25 ng/L及多聚賴氨酸375 pg/L的培養(yǎng)基為細(xì)胞換液,并培養(yǎng)細(xì)胞48 h。之后,細(xì)胞達(dá)到80%融合。將另一六孔板中的細(xì)胞以1:3比例傳代至新的3塊六孔板中,其中兩塊板的六個孔底部放置滅菌蓋玻片。其中一組細(xì)胞換以含15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng),而另一組細(xì)胞換以含5%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)。每隔24小時取出相應(yīng)組別的細(xì)胞爬片進(jìn)行固定、染色、檢測。其余細(xì)胞分別以兩種不同的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)傳代。將制備好的細(xì)胞爬片進(jìn)行普魯士藍(lán)染色并估測細(xì)胞氧化鐵顆粒標(biāo)記率。 結(jié)果:SPIO標(biāo)記干細(xì)胞48小時后,細(xì)胞爬片普魯士藍(lán)染色可見所有細(xì)胞中均含有藍(lán)染顆粒,位于細(xì)胞核周圍。將SPIO標(biāo)記的細(xì)胞以不同條件的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),兩組細(xì)胞SPIO標(biāo)記率均逐漸減低,細(xì)胞中鐵顆粒的量逐漸減少。以含15%胎牛血清的高糖DMEM繼續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞組,標(biāo)記后72小時細(xì)胞達(dá)到80%融合,進(jìn)行第一次傳代,傳代后24小時,SPIO標(biāo)記率較前略有降低(98±4.39)%(P=0.0409),培養(yǎng)72小時后,第二次傳代,傳代后24小時,細(xì)胞SPIO標(biāo)記率降低為(88.67±3.93)%,與第一次傳代后相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.0004)。繼續(xù)培養(yǎng)72小時后,第三次傳代,傳代后24小時可見SPIO標(biāo)記率進(jìn)一步降低至(44.5±7.74)%,與第二次傳代后24小時相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.0001)。第四次傳代后24小時,SPIO標(biāo)記率為(6.17±2.64)%。以含5%FBS的低糖DMEM繼續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞組,標(biāo)記后96小時細(xì)胞達(dá)到80%融合,進(jìn)行第一次傳代,傳代后24小時,SPIO標(biāo)記率較前略有降低(97±0.86)%(P=0.0172),培養(yǎng)120小時后,第二次傳代,傳代后24小時,細(xì)胞SPIO標(biāo)記率降低為(87±4.29)%,與第一次傳代后相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.0004)。繼續(xù)培養(yǎng)144小時后,第三次傳代,傳代后24小時可見SPIO標(biāo)記率進(jìn)一步降低至(46.7±7.06)%,與第二次傳代后24小時相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.0001)。第四次傳代后24小時,SPIO標(biāo)記率為第四次傳代后24小時,SPIO標(biāo)記率為(5.17±3.06)%。在兩組細(xì)胞,均在標(biāo)記以后第四次傳代后24小時,SPIO的標(biāo)記率下降至10%以下,在高糖DMEM組歷時9天,而在低糖DMEM組歷時16天。在標(biāo)記后第四次傳代后24小時,兩組細(xì)胞SPIO標(biāo)記率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[(5.17±3.06)%比(6.17±2.64)%,P=0.558]。 結(jié)論SPIO標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞排除SPIO的機(jī)制主要為細(xì)胞的分裂增殖。細(xì)胞分裂增殖越快,細(xì)胞清除SPIO的速率也越快。
【圖文】：

光鏡下的明膠微球

明膠微球于體外前3天釋放VEGF速度較快，，之后釋放速度漸減慢，約第10天后達(dá)到平臺期
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R542.22;R445.2

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本文編號：2663238