【摘要】：目的： 構(gòu)建沉默人survivin基因的siRNA真核表達(dá)載體，采用聚乙烯亞胺膽固醇衍生物將載體連接到脂質(zhì)微泡，并對(duì)微泡進(jìn)行靶向修飾，使其與乳腺癌細(xì)胞膜表面HER-2抗原特異性結(jié)合，探索一種新型的乳腺癌RNA干擾治療基因轉(zhuǎn)染工具。 方法： 1.采用免疫熒光法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞膜表面HER-2抗原；采用機(jī)械振蕩法制備脂質(zhì)微泡，生物素-親和素橋接法將靶向乳腺癌細(xì)胞膜表面抗原HER-2抗體赫賽汀連接到脂質(zhì)微泡上，觀察微泡的形態(tài)、密度、粒徑及分布范圍，并考察其與表達(dá)HER-2的乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3特異性結(jié)合的能力。 2.設(shè)計(jì)合成靶向人survivin基因的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的siRNA模板，克隆至真核表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-survivin，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞TOP10菌株，擴(kuò)增并提取質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定、序列測(cè)定。 3.以聚乙烯亞胺、膽固醇甲酰氯為原料合成陽(yáng)離子脂質(zhì)PEI-Chol，瓊脂糖凝膠電泳阻滯試驗(yàn)檢測(cè)不同N/P比對(duì)PEI-Chol結(jié)合質(zhì)粒DNA能力及PEI-Chol/DNA復(fù)合物抗核酸酶DNase I酶解的能力。 4.采用反相蒸發(fā)-機(jī)械振蕩法制備載siRNA真核表達(dá)載體的脂質(zhì)微泡，生物素-親和素橋接法將赫賽汀抗體偶聯(lián)到脂質(zhì)微泡，構(gòu)建攜siRNA真核表達(dá)載體的靶向微泡，顯微鏡觀察微泡的形態(tài)、密度、粒徑及分布范圍，觀察載基因靶向微泡與乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3的結(jié)合能力。 結(jié)果： 1.免疫熒光結(jié)果顯示，SK-BR-3細(xì)胞可與赫賽汀結(jié)合發(fā)出綠色熒光，而MDA-MB-231未見熒光；采用機(jī)械振蕩法制備的脂質(zhì)微泡分散良好，粒徑分布較均勻，平均粒徑為(3.1±0.7)μm，密度為1.6×10~8/ml，生物素-親和素橋接法成功將赫賽汀偶聯(lián)到脂質(zhì)微泡；靶向脂質(zhì)微泡微泡特異性結(jié)合到表達(dá)HER-2的SK-BR-3細(xì)胞。 2.靶向survivin的siRNA成功克隆到pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒載體，重組載體可被限制性內(nèi)切酶BamH I切開，而不能被Bbs I切開，基因測(cè)序證實(shí)為survivinsiRNA的真核表達(dá)載體。 3.當(dāng)N/P為3.75時(shí)，質(zhì)粒DNA完全被PEI-Chol及PEI包裹；當(dāng)N／P比降為1.88時(shí)，泳道上可見游離DNA條帶熒光，且PEI-Chol對(duì)質(zhì)粒DNA的包裹能力高于PEI。PEI-Chol包裹質(zhì)粒DNA可保護(hù)DNA免受核酸酶DNase I降解。 4.反相蒸發(fā)-機(jī)械振蕩法制備的載siRNA真核表達(dá)載體的脂質(zhì)微泡平均粒徑為(3.8±0.9)μm，密度為1.3×10~8/ml，與赫賽汀抗體偶聯(lián)后可特異性結(jié)合到SK-BR-3細(xì)胞。 結(jié)論： 本研究成功構(gòu)建了沉默人survivin基因的siRNA真核表達(dá)載體，通過聚乙烯亞胺膽固醇衍生物結(jié)合到脂質(zhì)微泡，并對(duì)載基因微泡進(jìn)行靶向修飾，可特異性結(jié)合到表達(dá)HER-2的人乳腺癌細(xì)胞，，為乳腺癌RNA干擾治療提供一種新型的基因轉(zhuǎn)移工具。
【圖文】：

圖 1 SK-BR-3 細(xì)胞系光學(xué)顯微鏡圖（×200）Fig.1 SK-BR-3 cell line (×200)圖 2 MDA-MB-231 細(xì)胞系光學(xué)顯微鏡圖（×200）Fig.2 MDA-MB-231 cell line (×200)

10圖 2 MDA-MB-231 細(xì)胞系光學(xué)顯微鏡圖（×200）Fig.2 MDA-MB-231 cell line (×200)胞化學(xué)鑒定微鏡下 SK-BR-3 細(xì)胞表面可見綠色熒光（圖 3），PBS 未見熒光（圖 4）。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R445.1;R737.9

【參考文獻(xiàn)】

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