【摘要】： 第一部分：利用磁共振技術(shù)對移植到心臟內(nèi)的鐵磁性標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進行在體示蹤的實驗研究 目的：細(xì)胞移植是目前缺血性心臟病治療研究的熱點之一。目前大多動物實驗中對于細(xì)胞移植到體內(nèi)之后的存留、分化、遷移等的研究需要通過病理組織切片進行。本實驗的主要目的是尋找一種能夠?qū)σ浦布?xì)胞進行在體示蹤的手段，以能夠?qū)σ浦布?xì)胞在體內(nèi)的存留、分布、遷移進行在體評價。 方法：實驗方法分為體內(nèi)和體外實驗兩部分，針對一種全新的細(xì)胞標(biāo)記試劑對細(xì)胞的標(biāo)記效率、對細(xì)胞的生長、分化、遷移的影響以及標(biāo)記后的細(xì)胞直接心肌內(nèi)注射移植和經(jīng)冠狀動脈內(nèi)注射移植后的在體顯影和在體顯影維持時間進行了研究。 體外實驗部分：從中華小型豬髂骨處抽取骨髓，體外培養(yǎng)擴增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并進行鑒定。將鐵磁性造影劑和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共同孵育培養(yǎng)36-48小時。使用普魯士藍染色標(biāo)記后的細(xì)胞評價鐵離子標(biāo)記的效率；使用MTT比色實驗評價標(biāo)記對細(xì)胞生長能力的影響；使用臺盼藍染色檢驗標(biāo)記后細(xì)胞的活性；用Costar Transwell24孔培養(yǎng)板進行細(xì)胞對化學(xué)因子的遷移實驗，評價細(xì)胞標(biāo)記后的遷移能力是否受影響；使用細(xì)胞分化誘導(dǎo)液評價細(xì)胞標(biāo)記后的分化能力。 體內(nèi)實驗部分： 1．心肌內(nèi)直接注射移植：結(jié)扎冠狀動脈前降支建立豬的心肌梗死模型(n=15)，模型建立后10天將鐵離子標(biāo)記的自體骨髓間質(zhì)細(xì)胞(1×10~7細(xì)胞／只動物)通過心肌內(nèi)直接注射方法移植到梗死或正常心肌組織內(nèi)，分別在細(xì)胞移植后當(dāng)天、1周、2周、3周、4周進行常規(guī)心臟磁共振檢查，對移植細(xì)胞進行在體顯像。另外5只動物作為對照組，，移植未標(biāo)記的骨髓間質(zhì)細(xì)胞。分別在細(xì)胞移植后不同時間取才動物心臟標(biāo)本，切片進行普魯士藍染色觀察細(xì)胞在心肌內(nèi)的分布和形態(tài)。 2．經(jīng)冠狀動脈內(nèi)注射移植：在這部分實驗中我們采用豬的缺血再灌注模型進行研究，將冠狀動脈阻斷90分鐘后開放，通過導(dǎo)管將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞直接注射到梗死相關(guān)的冠狀動脈內(nèi)。實驗組6只，注射鐵離子標(biāo)記的細(xì)胞，對照組3只注射未經(jīng)標(biāo)記的骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞。分別在細(xì)胞移植后當(dāng)天、1周、3周進行磁共振檢查和病理組織取材。在組織取材時同時取肺臟、肝臟、脾臟、腎臟組織進行切片，觀察細(xì)胞經(jīng)冠狀動脈內(nèi)注射移植后在全身非靶器官的分布情況。 結(jié)果 體外實驗部分： 鐵離子轉(zhuǎn)染后，骨髓間質(zhì)細(xì)胞普魯士藍染色發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞漿內(nèi)有藍色顆粒存在，細(xì)胞染色陽性率為95％以上；MTT實驗表明不同濃度的鐵磁性標(biāo)記物對細(xì)胞增殖沒有明顯的影響；臺盼藍染色顯示標(biāo)記后98％的細(xì)胞拒染臺盼藍；鐵磁性標(biāo)記物對rhSDF-1和VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移能力沒有影響；鐵離子標(biāo)記后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞的分化能力不受影響。 體內(nèi)實驗部分： 1．心肌內(nèi)直接注射：鐵離子標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞直接注射到心肌組織內(nèi)后，注射點均可通過磁共振顯像，表現(xiàn)為明顯的低信號灶影或信號缺失影像。動態(tài)觀察顯示細(xì)胞顯像可以持續(xù)到移植后4周，信號影呈動態(tài)變化，強度減低，范圍擴大。病理學(xué)檢查可以見移植細(xì)胞呈普魯士藍染色陽性，并與磁共振影像學(xué)的顯影有很好的一致性。移植后早期細(xì)胞在心肌內(nèi)聚集成“島狀”，在移植后1周存活的細(xì)胞在心肌內(nèi)散在分布，并且按相同的方向排列。普魯士藍染的顆粒均在存活的細(xì)胞胞漿內(nèi)，未見單獨存在的普魯士藍染色顆粒在梗死的心肌組織內(nèi)存在。對照組未發(fā)現(xiàn)注射點顯像和普魯士藍染色陽性細(xì)胞。 2．冠狀動脈內(nèi)注射：鐵離子標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)冠狀動脈內(nèi)注射后，可在磁共振檢查中顯影，移植細(xì)胞在相關(guān)心肌組織區(qū)域內(nèi)呈散在的點狀分布，表現(xiàn)為低密度信號影像，大小不一。病理組織學(xué)檢查中可見胞漿藍染的細(xì)胞在左心室前壁、室間隔、右心室前壁的心肌組織內(nèi)分布，與磁共振檢查影像有良好的一致性。移植后當(dāng)時細(xì)胞較均勻的分布在心肌組織內(nèi)，1周后細(xì)胞散在分布。在移植1周后的肺臟、脾臟、腎臟內(nèi)均可見大量的細(xì)胞存在，肝臟組織內(nèi)少見移植細(xì)胞分布。 結(jié)論：這種臨床應(yīng)用的超順磁性氧化鐵微顆粒磁共振造影劑，可以有效地標(biāo)記骨髓間質(zhì)細(xì)胞，不影響細(xì)胞形態(tài)、生長、增殖、分化，不影響細(xì)胞對化學(xué)趨化因子的遷移能力。利用心臟磁共振技術(shù)可以對心肌內(nèi)注射的以及冠狀動脈內(nèi)注射的鐵離子標(biāo)記的移植細(xì)胞進行在體示蹤。鐵離子標(biāo)記方法結(jié)合磁共振技術(shù)為移植細(xì)胞的在體示蹤和觀察細(xì)胞的存留、遷移提供了良好的手段。 第二部分：經(jīng)冠狀動脈內(nèi)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞移植后細(xì)胞的存留、分布、遷移及其機制的初步研究 Retention，Distribution，Migration of the Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells after Transcoronary Infusion and the Study of Migratory Mechanism of transplanted MSCs 實驗?zāi)康模汗跔顒用}內(nèi)細(xì)胞移植是目前臨床細(xì)胞移植的主要途徑，冠狀動脈內(nèi)細(xì)胞移植后移植細(xì)胞的存留、分布和遷移是關(guān)系細(xì)胞移植治療效果的重要因素之一。本實驗主要研究經(jīng)冠狀動脈內(nèi)注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后移植細(xì)胞在心臟內(nèi)的存留、分布和遷移情況以及在全身重要臟器內(nèi)的分布，同時對移植細(xì)胞向心肌梗死區(qū)域遷移的機制進行了初步研究。 實驗方法： 體外實驗部分： 1．骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)冠狀動脈內(nèi)注射后的存留比例 Lewis大鼠左側(cè)開胸結(jié)扎左冠狀動脈，制作心肌梗死模型。1周后取心臟建立離體心臟灌注模型。將Dil標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液注入主動脈根部，同時收集右心房回流的液體，離心后通過流式細(xì)胞儀計數(shù)細(xì)胞數(shù)量。觀察是否有細(xì)胞經(jīng)冠狀靜脈回流及數(shù)量比例。分別在細(xì)胞移植之前、細(xì)胞移植后5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘記錄左室收縮壓、左室舒張壓、左室±dp／dt、心率的變化，評價其安全性。 2．細(xì)胞的趨化實驗 體外實驗用Costar Transwell24孔培養(yǎng)板做細(xì)胞對于rh SDF-1、不同時期心肌梗死區(qū)域組織提取液的趨化研究以及間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)G蛋白阻滯劑PTx處理后的對其遷移能力的影響。 體內(nèi)實驗部分： 1．骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)冠狀動脈內(nèi)注射后在心臟內(nèi)及重要臟器分布： 取心梗后1周的大鼠，經(jīng)左心室-主動脈途徑將細(xì)胞懸液注射到臨時阻斷的主動脈根部，分別在移植后1小時、24小時、1周、4周取材觀察細(xì)胞在心臟內(nèi)的位置及細(xì)胞的遷移情況。 2．梗死組織內(nèi)SDF-1α的表達及細(xì)胞的趨化實驗 在心肌梗死后2小時、8小時、24小時、48小時、1周、2周、3周、6周取材心肌梗死區(qū)域心肌組織，RT-PCR的手段測量局部組織中SDF-1αRNA的基因表達。利用Costar Transwell細(xì)胞雙層培養(yǎng)板評價骨髓間充質(zhì)細(xì)胞向rh-SDF-1的遷移，以及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向不同時間的心肌梗死組織提取液的遷移能力，并評價細(xì)胞經(jīng)G-蛋白受體阻滯劑處理后向更斯心肌組織提取液遷移的變化。 實驗結(jié)果： 經(jīng)冠狀動脈內(nèi)注射髓間充質(zhì)干細(xì)胞后早期90％以上的細(xì)胞在心肌組織內(nèi)存留。經(jīng)主動脈根部將細(xì)胞注射到冠狀動脈內(nèi)后對左室收縮壓、左室舒張壓、左室±dp／dt、心率的變化沒有明顯影響。在體內(nèi)實驗中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞移植后早期大部分細(xì)胞分布在心外膜下心肌組織內(nèi)，在心內(nèi)膜下組織內(nèi)較少細(xì)胞分布，而且大部分細(xì)胞在正常心肌組織內(nèi)，只有少量在心梗區(qū)域。而在細(xì)胞移植后1—4周存活的細(xì)胞多在心肌梗死及交界區(qū)組織內(nèi)，在正常組織內(nèi)很少有移植細(xì)胞存在。在心肌梗死后24小時心梗局部組織心肌SDF-1的基因表達水平明顯升高，48小時達到峰值水平，在心梗后2周仍維持在較高水平，3-6周時恢復(fù)正常水平。MSCs對于SDF-1有明顯的劑量依賴性趨化作用，心肌梗死后的提取液對于細(xì)胞的趨化作用與SDF-1在心肌梗死區(qū)域的表達水平呈一致的變化趨勢，經(jīng)PTx處理后的細(xì)胞向心肌梗死提取液的趨化能力明顯降低。 實驗結(jié)論：、經(jīng)冠狀動脈內(nèi)途徑進行細(xì)胞移植是安全的可靠的，冠狀動脈內(nèi)注射進行細(xì)胞移植后大部分細(xì)胞在冠狀動脈內(nèi)存留，并有向心肌梗死區(qū)域遷移的趨勢。心肌梗死后局部組織中SDF-1的表達迅速升高并維持一定時間，可能是細(xì)胞遷移的主要因子，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向梗死心肌組織遷移可能主要是G-蛋白介導(dǎo)的。
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R445.2;R542.22
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本文編號：
2620104
