【摘要】： 第一部分：利用磁共振技術(shù)對(duì)移植到心臟內(nèi)的鐵磁性標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行在體示蹤的實(shí)驗(yàn)研究 目的：細(xì)胞移植是目前缺血性心臟病治療研究的熱點(diǎn)之一。目前大多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)于細(xì)胞移植到體內(nèi)之后的存留、分化、遷移等的研究需要通過病理組織切片進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)的主要目的是尋找一種能夠?qū)σ浦布?xì)胞進(jìn)行在體示蹤的手段，以能夠?qū)σ浦布?xì)胞在體內(nèi)的存留、分布、遷移進(jìn)行在體評(píng)價(jià)。 方法：實(shí)驗(yàn)方法分為體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)兩部分，針對(duì)一種全新的細(xì)胞標(biāo)記試劑對(duì)細(xì)胞的標(biāo)記效率、對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、遷移的影響以及標(biāo)記后的細(xì)胞直接心肌內(nèi)注射移植和經(jīng)冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射移植后的在體顯影和在體顯影維持時(shí)間進(jìn)行了研究。 體外實(shí)驗(yàn)部分：從中華小型豬髂骨處抽取骨髓，體外培養(yǎng)擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)行鑒定。將鐵磁性造影劑和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共同孵育培養(yǎng)36-48小時(shí)。使用普魯士藍(lán)染色標(biāo)記后的細(xì)胞評(píng)價(jià)鐵離子標(biāo)記的效率；使用MTT比色實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)標(biāo)記對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)能力的影響；使用臺(tái)盼藍(lán)染色檢驗(yàn)標(biāo)記后細(xì)胞的活性；用Costar Transwell24孔培養(yǎng)板進(jìn)行細(xì)胞對(duì)化學(xué)因子的遷移實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)細(xì)胞標(biāo)記后的遷移能力是否受影響；使用細(xì)胞分化誘導(dǎo)液評(píng)價(jià)細(xì)胞標(biāo)記后的分化能力。 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分： 1．心肌內(nèi)直接注射移植：結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支建立豬的心肌梗死模型(n=15)，模型建立后10天將鐵離子標(biāo)記的自體骨髓間質(zhì)細(xì)胞(1×10~7細(xì)胞／只動(dòng)物)通過心肌內(nèi)直接注射方法移植到梗死或正常心肌組織內(nèi)，分別在細(xì)胞移植后當(dāng)天、1周、2周、3周、4周進(jìn)行常規(guī)心臟磁共振檢查，對(duì)移植細(xì)胞進(jìn)行在體顯像。另外5只動(dòng)物作為對(duì)照組，，移植未標(biāo)記的骨髓間質(zhì)細(xì)胞。分別在細(xì)胞移植后不同時(shí)間取才動(dòng)物心臟標(biāo)本，切片進(jìn)行普魯士藍(lán)染色觀察細(xì)胞在心肌內(nèi)的分布和形態(tài)。 2．經(jīng)冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射移植：在這部分實(shí)驗(yàn)中我們采用豬的缺血再灌注模型進(jìn)行研究，將冠狀動(dòng)脈阻斷90分鐘后開放，通過導(dǎo)管將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞直接注射到梗死相關(guān)的冠狀動(dòng)脈內(nèi)。實(shí)驗(yàn)組6只，注射鐵離子標(biāo)記的細(xì)胞，對(duì)照組3只注射未經(jīng)標(biāo)記的骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞。分別在細(xì)胞移植后當(dāng)天、1周、3周進(jìn)行磁共振檢查和病理組織取材。在組織取材時(shí)同時(shí)取肺臟、肝臟、脾臟、腎臟組織進(jìn)行切片，觀察細(xì)胞經(jīng)冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射移植后在全身非靶器官的分布情況。 結(jié)果 體外實(shí)驗(yàn)部分： 鐵離子轉(zhuǎn)染后，骨髓間質(zhì)細(xì)胞普魯士藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞漿內(nèi)有藍(lán)色顆粒存在，細(xì)胞染色陽性率為95％以上；MTT實(shí)驗(yàn)表明不同濃度的鐵磁性標(biāo)記物對(duì)細(xì)胞增殖沒有明顯的影響；臺(tái)盼藍(lán)染色顯示標(biāo)記后98％的細(xì)胞拒染臺(tái)盼藍(lán)；鐵磁性標(biāo)記物對(duì)rhSDF-1和VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移能力沒有影響；鐵離子標(biāo)記后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞的分化能力不受影響。 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分： 1．心肌內(nèi)直接注射：鐵離子標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞直接注射到心肌組織內(nèi)后，注射點(diǎn)均可通過磁共振顯像，表現(xiàn)為明顯的低信號(hào)灶影或信號(hào)缺失影像。動(dòng)態(tài)觀察顯示細(xì)胞顯像可以持續(xù)到移植后4周，信號(hào)影呈動(dòng)態(tài)變化，強(qiáng)度減低，范圍擴(kuò)大。病理學(xué)檢查可以見移植細(xì)胞呈普魯士藍(lán)染色陽性，并與磁共振影像學(xué)的顯影有很好的一致性。移植后早期細(xì)胞在心肌內(nèi)聚集成“島狀”，在移植后1周存活的細(xì)胞在心肌內(nèi)散在分布，并且按相同的方向排列。普魯士藍(lán)染的顆粒均在存活的細(xì)胞胞漿內(nèi)，未見單獨(dú)存在的普魯士藍(lán)染色顆粒在梗死的心肌組織內(nèi)存在。對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)注射點(diǎn)顯像和普魯士藍(lán)染色陽性細(xì)胞。 2．冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射：鐵離子標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射后，可在磁共振檢查中顯影，移植細(xì)胞在相關(guān)心肌組織區(qū)域內(nèi)呈散在的點(diǎn)狀分布，表現(xiàn)為低密度信號(hào)影像，大小不一。病理組織學(xué)檢查中可見胞漿藍(lán)染的細(xì)胞在左心室前壁、室間隔、右心室前壁的心肌組織內(nèi)分布，與磁共振檢查影像有良好的一致性。移植后當(dāng)時(shí)細(xì)胞較均勻的分布在心肌組織內(nèi)，1周后細(xì)胞散在分布。在移植1周后的肺臟、脾臟、腎臟內(nèi)均可見大量的細(xì)胞存在，肝臟組織內(nèi)少見移植細(xì)胞分布。 結(jié)論：這種臨床應(yīng)用的超順磁性氧化鐵微顆粒磁共振造影劑，可以有效地標(biāo)記骨髓間質(zhì)細(xì)胞，不影響細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)、增殖、分化，不影響細(xì)胞對(duì)化學(xué)趨化因子的遷移能力。利用心臟磁共振技術(shù)可以對(duì)心肌內(nèi)注射的以及冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射的鐵離子標(biāo)記的移植細(xì)胞進(jìn)行在體示蹤。鐵離子標(biāo)記方法結(jié)合磁共振技術(shù)為移植細(xì)胞的在體示蹤和觀察細(xì)胞的存留、遷移提供了良好的手段。 第二部分：經(jīng)冠狀動(dòng)脈內(nèi)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞移植后細(xì)胞的存留、分布、遷移及其機(jī)制的初步研究 Retention，Distribution，Migration of the Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells after Transcoronary Infusion and the Study of Migratory Mechanism of transplanted MSCs 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模汗跔顒?dòng)脈內(nèi)細(xì)胞移植是目前臨床細(xì)胞移植的主要途徑，冠狀動(dòng)脈內(nèi)細(xì)胞移植后移植細(xì)胞的存留、分布和遷移是關(guān)系細(xì)胞移植治療效果的重要因素之一。本實(shí)驗(yàn)主要研究經(jīng)冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后移植細(xì)胞在心臟內(nèi)的存留、分布和遷移情況以及在全身重要臟器內(nèi)的分布，同時(shí)對(duì)移植細(xì)胞向心肌梗死區(qū)域遷移的機(jī)制進(jìn)行了初步研究。 實(shí)驗(yàn)方法： 體外實(shí)驗(yàn)部分： 1．骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射后的存留比例 Lewis大鼠左側(cè)開胸結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈，制作心肌梗死模型。1周后取心臟建立離體心臟灌注模型。將Dil標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液注入主動(dòng)脈根部，同時(shí)收集右心房回流的液體，離心后通過流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量。觀察是否有細(xì)胞經(jīng)冠狀靜脈回流及數(shù)量比例。分別在細(xì)胞移植之前、細(xì)胞移植后5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘記錄左室收縮壓、左室舒張壓、左室±dp／dt、心率的變化，評(píng)價(jià)其安全性。 2．細(xì)胞的趨化實(shí)驗(yàn) 體外實(shí)驗(yàn)用Costar Transwell24孔培養(yǎng)板做細(xì)胞對(duì)于rh SDF-1、不同時(shí)期心肌梗死區(qū)域組織提取液的趨化研究以及間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)G蛋白阻滯劑PTx處理后的對(duì)其遷移能力的影響。 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分： 1．骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射后在心臟內(nèi)及重要臟器分布： 取心梗后1周的大鼠，經(jīng)左心室-主動(dòng)脈途徑將細(xì)胞懸液注射到臨時(shí)阻斷的主動(dòng)脈根部，分別在移植后1小時(shí)、24小時(shí)、1周、4周取材觀察細(xì)胞在心臟內(nèi)的位置及細(xì)胞的遷移情況。 2．梗死組織內(nèi)SDF-1α的表達(dá)及細(xì)胞的趨化實(shí)驗(yàn) 在心肌梗死后2小時(shí)、8小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、1周、2周、3周、6周取材心肌梗死區(qū)域心肌組織，RT-PCR的手段測(cè)量局部組織中SDF-1αRNA的基因表達(dá)。利用Costar Transwell細(xì)胞雙層培養(yǎng)板評(píng)價(jià)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞向rh-SDF-1的遷移，以及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向不同時(shí)間的心肌梗死組織提取液的遷移能力，并評(píng)價(jià)細(xì)胞經(jīng)G-蛋白受體阻滯劑處理后向更斯心肌組織提取液遷移的變化。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 經(jīng)冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射髓間充質(zhì)干細(xì)胞后早期90％以上的細(xì)胞在心肌組織內(nèi)存留。經(jīng)主動(dòng)脈根部將細(xì)胞注射到冠狀動(dòng)脈內(nèi)后對(duì)左室收縮壓、左室舒張壓、左室±dp／dt、心率的變化沒有明顯影響。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞移植后早期大部分細(xì)胞分布在心外膜下心肌組織內(nèi)，在心內(nèi)膜下組織內(nèi)較少細(xì)胞分布，而且大部分細(xì)胞在正常心肌組織內(nèi)，只有少量在心梗區(qū)域。而在細(xì)胞移植后1—4周存活的細(xì)胞多在心肌梗死及交界區(qū)組織內(nèi)，在正常組織內(nèi)很少有移植細(xì)胞存在。在心肌梗死后24小時(shí)心梗局部組織心肌SDF-1的基因表達(dá)水平明顯升高，48小時(shí)達(dá)到峰值水平，在心梗后2周仍維持在較高水平，3-6周時(shí)恢復(fù)正常水平。MSCs對(duì)于SDF-1有明顯的劑量依賴性趨化作用，心肌梗死后的提取液對(duì)于細(xì)胞的趨化作用與SDF-1在心肌梗死區(qū)域的表達(dá)水平呈一致的變化趨勢(shì)，經(jīng)PTx處理后的細(xì)胞向心肌梗死提取液的趨化能力明顯降低。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：、經(jīng)冠狀動(dòng)脈內(nèi)途徑進(jìn)行細(xì)胞移植是安全的可靠的，冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射進(jìn)行細(xì)胞移植后大部分細(xì)胞在冠狀動(dòng)脈內(nèi)存留，并有向心肌梗死區(qū)域遷移的趨勢(shì)。心肌梗死后局部組織中SDF-1的表達(dá)迅速升高并維持一定時(shí)間，可能是細(xì)胞遷移的主要因子，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向梗死心肌組織遷移可能主要是G-蛋白介導(dǎo)的。
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R445.2;R542.22

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5 王晨;成熟心肌細(xì)胞異體移植對(duì)心肌梗死后心功能的保護(hù)作用[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2005年

6 黃海怡;骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植治療擴(kuò)張型心肌病的動(dòng)物與臨床研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2005年

7 程立松;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠心肌梗死[D];天津醫(yī)科大學(xué);2005年

8 張承韶;骨髓來源的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞移植治療下肢缺血的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[D];青島大學(xué);2007年

9 何薇;內(nèi)皮祖細(xì)胞體外移植及他汀類藥物對(duì)大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用及療效比較[D];大連醫(yī)科大學(xué);2009年

10 赫連曼;內(nèi)皮祖細(xì)胞移植治療野百合堿誘導(dǎo)大鼠肺動(dòng)脈高壓的研究[D];南昌大學(xué);2009年

本文編號(hào)：2620104