本文關(guān)鍵詞：外泌體—電離輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)的另一種機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《蘇州大學(xué)》 2014年

外泌體—電離輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)的另一種機(jī)制

陳纖  

【摘要】：目的： 首先驗(yàn)證電離輻射是否在H460非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)經(jīng)培養(yǎng)液介導(dǎo)的旁效應(yīng)；進(jìn)而探索除細(xì)胞間隙連接和可溶性分子兩種信號(hào)介導(dǎo)方式外的新的旁效應(yīng)信號(hào)介導(dǎo)機(jī)制。在文獻(xiàn)調(diào)研與預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)之上，探索外泌體是否為電離輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)的一種介導(dǎo)機(jī)制。 方法： 采用條件培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移的方法，，以DNA損傷、微核形成和克隆形成為指標(biāo)，檢測(cè)X射線在H460非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)經(jīng)培養(yǎng)液介導(dǎo)的旁效應(yīng)。采用差速離心法從未輻照和輻照后的H460細(xì)胞培養(yǎng)液中提取、純化外泌體，通過透射電子顯微鏡觀察其形態(tài)，激光粒度儀分析粒徑分布，并用Western Blot檢測(cè)其標(biāo)志蛋白hsp90β的表達(dá)。另外，檢測(cè)不同照射劑量以及照射后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞分泌外泌體的粒徑分布。通過熒光探針共定位實(shí)驗(yàn)觀察外泌體進(jìn)入接收細(xì)胞。采用結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)檢測(cè)外泌體對(duì)接收細(xì)胞增殖的影響，同時(shí)檢測(cè)外泌體對(duì)接收細(xì)胞微核形成和克隆形成能力的影響。為探索外泌體中的RNA是否對(duì)引起接收細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)變化發(fā)揮重要作用，預(yù)先將RNA酶與外泌體孵育以滅活外泌體內(nèi)RNA，去除殘留RNA酶后，將外泌體加入接收細(xì)胞中，觀察接收細(xì)胞微核形成率的變化。本研究采用Origin8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、分析和作圖，采用Student’s t-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，當(dāng)p值小于0.05時(shí)，認(rèn)為兩比較組間的差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。全部數(shù)據(jù)均來源于最少三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差表示。 結(jié)果： 1.條件培養(yǎng)液介導(dǎo)電離輻射旁效應(yīng)。相對(duì)于未受照射條件培養(yǎng)液（SCM）轉(zhuǎn)移組，將5Gy X射線照射后1小時(shí)的H460細(xì)胞條件培養(yǎng)液（RCM）轉(zhuǎn)移到未做任何處理的旁效應(yīng)細(xì)胞，旁效應(yīng)細(xì)胞微核形成率增加了80%，克隆形成率降低了13%。相對(duì)于未受照射條件培養(yǎng)液（SCM）轉(zhuǎn)移組，將5Gy X射線照射后18小時(shí)的H460細(xì)胞條件培養(yǎng)液（RCM）轉(zhuǎn)移到未做任何處理的旁效應(yīng)細(xì)胞，旁效應(yīng)細(xì)胞微核形成率增加了3.5-5倍，克隆形成率降低了8.3%，DNA損傷增加了18%。并且，無論1小時(shí)還是18小時(shí)條件培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移，5Gy X射線照射后的條件培養(yǎng)液和10Gy X射線照射后的條件培養(yǎng)液產(chǎn)生的微核形成率沒有明顯差別。 2.外泌體的分離和鑒定。采用差速離心法，可以簡(jiǎn)便、快速地獲得外泌體。透射電鏡下可見典型的外泌體“盤杯狀”特征，大小在30-150nm。進(jìn)一步通過WesternBlot檢測(cè)普遍接受的外泌體標(biāo)志物Hsp90β，確證提取物為外泌體。不管是否受到照射，H460細(xì)胞均分泌外泌體，但是在兩種情形下細(xì)胞分泌的外泌體的粒徑分布卻完全不同。并且，細(xì)胞分泌的外泌體尺寸依賴于細(xì)胞受照劑量和照射后培養(yǎng)時(shí)間。 3.外泌體與H460接收細(xì)胞的相互作用。將用熒光探針分別標(biāo)記的外泌體與接收細(xì)胞共培養(yǎng)30分鐘后，觀察到從未受照射和受照射細(xì)胞培養(yǎng)液提取的外泌體均可迅速進(jìn)入H460接收細(xì)胞中，可能是通過膜融合的方式。 4.從條件培養(yǎng)液提取的外泌體可誘導(dǎo)接收細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。加入從未受照射細(xì)胞培養(yǎng)液提取純化的外泌體不改變接收細(xì)胞的微核形成率，然而，從受照射細(xì)胞培養(yǎng)液提取純化的外泌體使接收細(xì)胞的微核形成率增加了兩倍。用RNA酶預(yù)先除去外泌體中RNA，再將此外泌體加入接收細(xì)胞，之前觀察到的細(xì)胞受照后條件培養(yǎng)液中提取的外泌體使接收細(xì)胞的微核形成率增加的生物學(xué)效應(yīng)消失。另外，不管是否受照，與新鮮培養(yǎng)液對(duì)照組相比，H460細(xì)胞分泌的外泌體均能促進(jìn)接收細(xì)胞增殖（增加11%左右）。但是，不管是否受照，與新鮮培養(yǎng)液對(duì)照組相比H460細(xì)胞分泌的外泌體均不影響接收細(xì)胞的克隆形成率。 結(jié)論： 1.X射線可在H460細(xì)胞中誘導(dǎo)經(jīng)培養(yǎng)液介導(dǎo)的電離輻射旁效應(yīng)。 2.不管是否受到照射，H460細(xì)胞均分泌外泌體，但是兩種情形下外泌體的粒徑分布卻完全不同。細(xì)胞分泌的外泌體尺寸依賴于細(xì)胞受照劑量和照射后培養(yǎng)時(shí)間。 3.外泌體可能通過膜融合的方式進(jìn)入H460接收細(xì)胞。 4.外泌體可能是電離輻射旁效應(yīng)的一種介導(dǎo)機(jī)制，并且其中RNA可能是一種重要的旁效應(yīng)信號(hào)分子。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R730.55
【目錄】：

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