本文關(guān)鍵詞：水貂阿留申病病毒分子流行病學調(diào)查及間接ELISA檢測方法的建立及初步應(yīng)用

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【摘要】：近年來,受市場需求的刺激,水貂養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展。山東也成為了我國水貂的養(yǎng)殖大省。但是,隨著水貂養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大,一些疫病也成為了制約水貂養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素。水貂阿留申病(Aleutian Mink Disease,AD),作為毛皮動物三大疫病之一(阿留申病、病毒性腸炎、犬瘟熱)(李艷伍等.,2009),會造成水貂的毛皮質(zhì)量的下降,對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。但是,目前,還沒有專門的藥物或者疫苗來防治此病,只能通過檢疫淘汰病貂達到對貂群的凈化。因此,研究水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus,ADV)在山東地區(qū)的分子生物學特點,建立一種特異性的檢測方法具有重要意義。在2014-2015年間,本實驗室對檢測到的患水貂阿留申病的水貂臟器進行研磨,將研磨液接種到貓腎細胞(CRFK)中分離培養(yǎng)。當細胞出現(xiàn)穩(wěn)定的病變后,提取細胞DNA進行PCR檢測,結(jié)果呈現(xiàn)阿留申陽性。將擴增的序列進行測序,與參考序列ADV-G比對后,核苷酸同源性達到92.6%。但是,隨著病毒傳代次數(shù)的增加,細胞病變逐漸消失,PCR檢測呈現(xiàn)陰性。說明該病毒不能在貓腎細胞中穩(wěn)定傳代。同時,我們對從山東省諸城某水貂養(yǎng)殖場采集的134份水貂實質(zhì)器官進行檢測,發(fā)現(xiàn)有37株呈現(xiàn)水貂阿留申病陽性,陽性率達到27.6%。對37株水貂阿留申病毒進行VP2基因的擴增并進行序列測定。用生物軟件分析后發(fā)現(xiàn),37株測序株間VP2基因核苷酸相似性為88%-99.8%,與GenBank中參考序列的相似性為88.0%-100%。并且,我們觀察到:山東地區(qū)水貂阿留申病毒VP2基因存在大量的突變位點。將測序株與參考株經(jīng)進化樹分析后,分成5個分支(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)。VP2基因進化樹顯示89%的國內(nèi)毒株處在進化樹的第Ⅰ和第Ⅴ分支,而這兩個分支不包含國外毒株。其中,有78.4%的毒株處在第Ⅰ分支。余下的11%的國內(nèi)毒株則與其他國外毒株有較近的親緣關(guān)系。這說明我國水貂阿留申病毒已經(jīng)有別于國外毒株,形成了自己的獨立進化支。由于大多數(shù)分離到的毒株處于第Ⅰ分支,我們暫且認為可能山東地區(qū)的毒株在向第Ⅰ分支進化的趨勢。這對找出本地區(qū)流行的水貂阿留申病毒的標準毒株,以便進行對該病的檢測提供科學依據(jù)。為了進一步研究分離到的37株病毒VP2基因的分子特征,用DNASTAR軟件分別推導(dǎo)出各基因片段的氨基酸序列,并與參考毒株進行比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn):測序株間氨基酸的相似性為89.2%-99.7%,與參考序列間的相似性87.7%-100%�？v觀VP2的整個氨基酸序列中,突變較多,有超過100多個氨基酸的突變。突變較集中的區(qū)域有三個,其中包括免疫反應(yīng)區(qū)VP2:429-524。有14個突變位點只存在于中國毒株。其中,位點204:V-I、305:K-T、308:T-S、419:L-I、436:I-M的突變,突變毒株超過10個。419:L-I、436:N-D兩個突變存在于VP2:428-446區(qū)域,而該區(qū)域可能影響水貂阿留申病毒的宿主范圍的選擇(McKenna et al.,1999)。對于其它幾個頻率較高的突變,我們目前還沒有確切的研究來表明它突變的意義。其次,本實驗室針對VP2序列的高免疫反應(yīng)區(qū)(430-525)進行原核表達,并建立了間接ELISA檢測方法。將擴增出的序列與pET-32a原核表達載體連接,在大腸桿菌BL21中進行表達。當誘導(dǎo)劑IPTG的濃度為1mmol/L,在37℃誘導(dǎo)4h的表達量最高。表達蛋白經(jīng)Western blot檢測后具有良好的反應(yīng)原性。將純化蛋白包被酶標板,通過優(yōu)化條件,建立了間接ELISA檢測方法。用建立好的方法對84份送檢的血清樣本進行檢測,檢出率為26.2%。
【關(guān)鍵詞】：水貂 阿留申病毒 分離鑒定 VP2基因 分子流行病學調(diào)查 間接ELISA檢測
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.92
【目錄】：

• 中文摘要9-11
• Abstract11-13
• 前言13-14
• 1 綜述14-25
• 1.1 ADV的生物學特性14-15
• 1.1.1 ADV的分類地位14
• 1.1.2 ADV的形態(tài)特征14
• 1.1.3 ADV的理化特性14-15
• 1.1.4 ADV的培養(yǎng)特性15
• 1.2 ADV的分子生物學研究15-18
• 1.2.1 ADV的基因組特點15-16
• 1.2.2 ADV基因的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄16
• 1.2.3 ADV編碼的蛋白16-18
• 1.3 水貂阿留申病的研究18-21
• 1.3.1 AD的流行病學18-19
• 1.3.2 AD的發(fā)病機理19-20
• 1.3.3 AD的臨床癥狀20
• 1.3.4 AD的病理變化20-21
• 1.4 AD的診斷21-23
• 1.4.1 病原學診斷21
• 1.4.2 血清學診斷21-22
• 1.4.3 分子生物學診斷22-23
• 1.5 AD的綜合防治23-24
• 1.6 本研究的目的及意義24-25
• 2 材料與方法25-42
• 2.1 材料25-27
• 2.1.1 病料25
• 2.1.2 主要試劑25
• 2.1.3 主要儀器25
• 2.1.4 質(zhì)粒與菌種25-26
• 2.1.5 試劑的配制26-27
• 2.2 方法27-42
• 2.2.1 水貂阿留申病毒的分離鑒定27-30
• 2.2.2 山東地區(qū)水貂阿留申病毒分子生物學特性的研究30-35
• 2.2.3 間接ELISA檢測方法的建立35-42
• 3 結(jié)果42-54
• 3.1 水貂阿留申病毒的分離鑒定結(jié)果42-44
• 3.1.1 PCR初步檢測結(jié)果42-43
• 3.1.2 ADV的分離結(jié)果43
• 3.1.3 ADV分離的PCR鑒定結(jié)果43-44
• 3.1.4 序列的核苷酸同源性比較44
• 3.2 山東地區(qū)水貂阿留申病毒分子生物學特性的研究結(jié)果44-47
• 3.2.1 PCR擴增結(jié)果44-45
• 3.2.2 酶切鑒定結(jié)果45-46
• 3.2.3 同源性分析與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果46-47
• 3.3 間接ELISA檢測方法的建立結(jié)果47-54
• 3.3.1 重組載體pMD18-T-VP2的PCR鑒定結(jié)果47
• 3.3.2 重組載體pMD18-T-VP2的酶切鑒定結(jié)果47-48
• 3.3.3 重組表達載體pET-32a-VP2的PCR鑒定結(jié)果48
• 3.3.4 重組表達載體pET-32a-VP2的酶切鑒定結(jié)果48-49
• 3.3.5 重組質(zhì)粒pET-32a-VP2的序列測定結(jié)果49
• 3.3.6 表達蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果49
• 3.3.7 表達蛋白的Western blot檢測結(jié)果49-50
• 3.3.8 純化蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果50
• 3.3.9 抗原包被濃度和一抗稀釋度的確定50-51
• 3.3.10 抗原包被條件的確定51
• 3.3.11 封閉液的確定51-52
• 3.3.12 封閉液作用時間的確定52
• 3.3.13 二抗最佳稀釋度的確定52
• 3.3.14 底物最佳作用時間的確定52-53
• 3.3.15 臨界值的確定53
• 3.3.16 特異性檢測結(jié)果53
• 3.3.17 敏感性檢測結(jié)果53
• 3.3.18 重復(fù)性檢測結(jié)果53
• 3.3.19 臨床樣本檢測結(jié)果53-54
• 4 討論54-59
• 4.1 水貂阿留申病毒的分離鑒定54-55
• 4.2 山東地區(qū)水貂阿留申病毒分子生物學特性的研究55-57
• 4.3 間接ELISA檢測方法的建立57-59
• 5 結(jié)論59-60
• 參考文獻60-68
• 攻讀學位期間發(fā)表論文情況68-69
• 致謝69

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1 畢世坤,薛強;水貂阿留申病的檢測技術(shù)總結(jié)[J];山東畜牧獸醫(yī);2003年05期

2 趙景彬,宋桂玲,李秀艷,高鴻飛,錢禮春;板藍根液治療水貂阿留申病[J];養(yǎng)殖技術(shù)顧問;2004年02期

3 舒寶麗;板藍根液治療水貂阿留申病[J];當代畜禽養(yǎng)殖業(yè);2004年10期

4 ;板藍根治療水貂阿留申病[J];北方牧業(yè);2005年24期

5 薛強;郭紹聰;;水貂阿留申病的檢測技術(shù)及應(yīng)用效果[J];當代畜牧;2006年12期

6 張慶明;王玉平;雷連成;;水貂阿留申病研究進展[J];河北科技師范學院學報;2011年04期

7 姚庭香,韓亞琴;水貂阿留申病生化紊亂的探討[J];中國獸醫(yī)雜志;1985年01期

8 于培耀;;板藍根巧治水貂阿留申病[J];農(nóng)業(yè)知識;2005年24期

9 鄭全,王樹志,王全凱;水貂阿留申病研究進展[J];經(jīng)濟動物學報;2002年04期

10 肖家美,趙景輝,李紅,趙艷;水貂阿留申病的危害及其防制[J];特種經(jīng)濟動植物;2003年12期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 楊莘;王建科;易立;許紅麗;羅彬;程世鵬;;水貂阿留申病研究進展[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物傳染病學分會第十二次人獸共患病學術(shù)研討會暨第六屆第十四次教學專業(yè)委員會論文集[C];2012年

2 孟慶峰;梁艷婷;蔡陽;錢愛東;王偉利;;水貂阿留申病毒主要VP2基因的原核表達[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第七屆全國會員代表大會暨第十三次學術(shù)研討會論文集（下冊）[C];2009年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 張卓;水貂阿留申病毒分離鑒定及其致病性研究和診斷方法的建立[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2015年

2 賈峗;水貂阿留申病毒(ADV)VP2蛋白體外表達與檢測技術(shù)應(yīng)用研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學;2016年

3 李艷伍;貂阿留申病病毒流行毒株分子特征及其VP2基因重組桿狀病毒免疫特性研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2012年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李晶;檢測水貂阿留申病Dot-ELISA方法的建立及初步驗證[D];吉林農(nóng)業(yè)大學;2015年

2 萬洪理;我國部分地區(qū)水貂阿留申病血清學調(diào)查[D];吉林農(nóng)業(yè)大學;2015年

3 白蕙箐;水貂阿留申病分子檢測及其對產(chǎn)仔性能的影響[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2015年

4 楊柳枝;水貂阿留申病ELISA抗體檢測試劑盒的研制及水貂阿留申病血清學調(diào)查[D];吉林大學;2016年

5 陳小微;水貂阿留申病毒抗體ELISA檢測方法的建立及應(yīng)用[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2016年

6 韓鎧懌;水貂阿留申病病毒分子流行病學調(diào)查及間接ELISA檢測方法的建立及初步應(yīng)用[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2016年

7 桑宇;水貂阿留申病流行病學調(diào)查[D];東北林業(yè)大學;2012年

8 王振軍;水貂阿留申病分子流行病學調(diào)查和間接ELISA檢測方法的建立[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2014年

9 黃盼盼;水貂阿留申病檢測抗原的制備及間接ELISA檢測方法的建立[D];吉林大學;2015年

10 張秀麗;水貂阿留申病流行病學調(diào)查及快速檢測方法建立[D];吉林農(nóng)業(yè)大學;2014年

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本文編號：740563