本文關(guān)鍵詞：水貂阿留申病病毒分子流行病學(xué)調(diào)查及間接ELISA檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

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【摘要】：近年來(lái),受市場(chǎng)需求的刺激,水貂養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展。山東也成為了我國(guó)水貂的養(yǎng)殖大省。但是,隨著水貂養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大,一些疫病也成為了制約水貂養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素。水貂阿留申病(Aleutian Mink Disease,AD),作為毛皮動(dòng)物三大疫病之一(阿留申病、病毒性腸炎、犬瘟熱)(李艷伍等.,2009),會(huì)造成水貂的毛皮質(zhì)量的下降,對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。但是,目前,還沒(méi)有專門的藥物或者疫苗來(lái)防治此病,只能通過(guò)檢疫淘汰病貂達(dá)到對(duì)貂群的凈化。因此,研究水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus,ADV)在山東地區(qū)的分子生物學(xué)特點(diǎn),建立一種特異性的檢測(cè)方法具有重要意義。在2014-2015年間,本實(shí)驗(yàn)室對(duì)檢測(cè)到的患水貂阿留申病的水貂臟器進(jìn)行研磨,將研磨液接種到貓腎細(xì)胞(CRFK)中分離培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)穩(wěn)定的病變后,提取細(xì)胞DNA進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果呈現(xiàn)阿留申陽(yáng)性。將擴(kuò)增的序列進(jìn)行測(cè)序,與參考序列ADV-G比對(duì)后,核苷酸同源性達(dá)到92.6%。但是,隨著病毒傳代次數(shù)的增加,細(xì)胞病變逐漸消失,PCR檢測(cè)呈現(xiàn)陰性。說(shuō)明該病毒不能在貓腎細(xì)胞中穩(wěn)定傳代。同時(shí),我們對(duì)從山東省諸城某水貂養(yǎng)殖場(chǎng)采集的134份水貂實(shí)質(zhì)器官進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)有37株呈現(xiàn)水貂阿留申病陽(yáng)性,陽(yáng)性率達(dá)到27.6%。對(duì)37株水貂阿留申病毒進(jìn)行VP2基因的擴(kuò)增并進(jìn)行序列測(cè)定。用生物軟件分析后發(fā)現(xiàn),37株測(cè)序株間VP2基因核苷酸相似性為88%-99.8%,與GenBank中參考序列的相似性為88.0%-100%。并且,我們觀察到:山東地區(qū)水貂阿留申病毒VP2基因存在大量的突變位點(diǎn)。將測(cè)序株與參考株經(jīng)進(jìn)化樹(shù)分析后,分成5個(gè)分支(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)。VP2基因進(jìn)化樹(shù)顯示89%的國(guó)內(nèi)毒株處在進(jìn)化樹(shù)的第Ⅰ和第Ⅴ分支,而這兩個(gè)分支不包含國(guó)外毒株。其中,有78.4%的毒株處在第Ⅰ分支。余下的11%的國(guó)內(nèi)毒株則與其他國(guó)外毒株有較近的親緣關(guān)系。這說(shuō)明我國(guó)水貂阿留申病毒已經(jīng)有別于國(guó)外毒株,形成了自己的獨(dú)立進(jìn)化支。由于大多數(shù)分離到的毒株處于第Ⅰ分支,我們暫且認(rèn)為可能山東地區(qū)的毒株在向第Ⅰ分支進(jìn)化的趨勢(shì)。這對(duì)找出本地區(qū)流行的水貂阿留申病毒的標(biāo)準(zhǔn)毒株,以便進(jìn)行對(duì)該病的檢測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。為了進(jìn)一步研究分離到的37株病毒VP2基因的分子特征,用DNASTAR軟件分別推導(dǎo)出各基因片段的氨基酸序列,并與參考毒株進(jìn)行比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn):測(cè)序株間氨基酸的相似性為89.2%-99.7%,與參考序列間的相似性87.7%-100%�？v觀VP2的整個(gè)氨基酸序列中,突變較多,有超過(guò)100多個(gè)氨基酸的突變。突變較集中的區(qū)域有三個(gè),其中包括免疫反應(yīng)區(qū)VP2:429-524。有14個(gè)突變位點(diǎn)只存在于中國(guó)毒株。其中,位點(diǎn)204:V-I、305:K-T、308:T-S、419:L-I、436:I-M的突變,突變毒株超過(guò)10個(gè)。419:L-I、436:N-D兩個(gè)突變存在于VP2:428-446區(qū)域,而該區(qū)域可能影響水貂阿留申病毒的宿主范圍的選擇(McKenna et al.,1999)。對(duì)于其它幾個(gè)頻率較高的突變,我們目前還沒(méi)有確切的研究來(lái)表明它突變的意義。其次,本實(shí)驗(yàn)室針對(duì)VP2序列的高免疫反應(yīng)區(qū)(430-525)進(jìn)行原核表達(dá),并建立了間接ELISA檢測(cè)方法。將擴(kuò)增出的序列與pET-32a原核表達(dá)載體連接,在大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá)。當(dāng)誘導(dǎo)劑IPTG的濃度為1mmol/L,在37℃誘導(dǎo)4h的表達(dá)量最高。表達(dá)蛋白經(jīng)Western blot檢測(cè)后具有良好的反應(yīng)原性。將純化蛋白包被酶標(biāo)板,通過(guò)優(yōu)化條件,建立了間接ELISA檢測(cè)方法。用建立好的方法對(duì)84份送檢的血清樣本進(jìn)行檢測(cè),檢出率為26.2%。
【關(guān)鍵詞】：水貂 阿留申病毒 分離鑒定 VP2基因 分子流行病學(xué)調(diào)查 間接ELISA檢測(cè)
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.92
【目錄】：

• 中文摘要9-11
• Abstract11-13
• 前言13-14
• 1 綜述14-25
• 1.1 ADV的生物學(xué)特性14-15
• 1.1.1 ADV的分類地位14
• 1.1.2 ADV的形態(tài)特征14
• 1.1.3 ADV的理化特性14-15
• 1.1.4 ADV的培養(yǎng)特性15
• 1.2 ADV的分子生物學(xué)研究15-18
• 1.2.1 ADV的基因組特點(diǎn)15-16
• 1.2.2 ADV基因的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄16
• 1.2.3 ADV編碼的蛋白16-18
• 1.3 水貂阿留申病的研究18-21
• 1.3.1 AD的流行病學(xué)18-19
• 1.3.2 AD的發(fā)病機(jī)理19-20
• 1.3.3 AD的臨床癥狀20
• 1.3.4 AD的病理變化20-21
• 1.4 AD的診斷21-23
• 1.4.1 病原學(xué)診斷21
• 1.4.2 血清學(xué)診斷21-22
• 1.4.3 分子生物學(xué)診斷22-23
• 1.5 AD的綜合防治23-24
• 1.6 本研究的目的及意義24-25
• 2 材料與方法25-42
• 2.1 材料25-27
• 2.1.1 病料25
• 2.1.2 主要試劑25
• 2.1.3 主要儀器25
• 2.1.4 質(zhì)粒與菌種25-26
• 2.1.5 試劑的配制26-27
• 2.2 方法27-42
• 2.2.1 水貂阿留申病毒的分離鑒定27-30
• 2.2.2 山東地區(qū)水貂阿留申病毒分子生物學(xué)特性的研究30-35
• 2.2.3 間接ELISA檢測(cè)方法的建立35-42
• 3 結(jié)果42-54
• 3.1 水貂阿留申病毒的分離鑒定結(jié)果42-44
• 3.1.1 PCR初步檢測(cè)結(jié)果42-43
• 3.1.2 ADV的分離結(jié)果43
• 3.1.3 ADV分離的PCR鑒定結(jié)果43-44
• 3.1.4 序列的核苷酸同源性比較44
• 3.2 山東地區(qū)水貂阿留申病毒分子生物學(xué)特性的研究結(jié)果44-47
• 3.2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果44-45
• 3.2.2 酶切鑒定結(jié)果45-46
• 3.2.3 同源性分析與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果46-47
• 3.3 間接ELISA檢測(cè)方法的建立結(jié)果47-54
• 3.3.1 重組載體pMD18-T-VP2的PCR鑒定結(jié)果47
• 3.3.2 重組載體pMD18-T-VP2的酶切鑒定結(jié)果47-48
• 3.3.3 重組表達(dá)載體pET-32a-VP2的PCR鑒定結(jié)果48
• 3.3.4 重組表達(dá)載體pET-32a-VP2的酶切鑒定結(jié)果48-49
• 3.3.5 重組質(zhì)粒pET-32a-VP2的序列測(cè)定結(jié)果49
• 3.3.6 表達(dá)蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果49
• 3.3.7 表達(dá)蛋白的Western blot檢測(cè)結(jié)果49-50
• 3.3.8 純化蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果50
• 3.3.9 抗原包被濃度和一抗稀釋度的確定50-51
• 3.3.10 抗原包被條件的確定51
• 3.3.11 封閉液的確定51-52
• 3.3.12 封閉液作用時(shí)間的確定52
• 3.3.13 二抗最佳稀釋度的確定52
• 3.3.14 底物最佳作用時(shí)間的確定52-53
• 3.3.15 臨界值的確定53
• 3.3.16 特異性檢測(cè)結(jié)果53
• 3.3.17 敏感性檢測(cè)結(jié)果53
• 3.3.18 重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果53
• 3.3.19 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果53-54
• 4 討論54-59
• 4.1 水貂阿留申病毒的分離鑒定54-55
• 4.2 山東地區(qū)水貂阿留申病毒分子生物學(xué)特性的研究55-57
• 4.3 間接ELISA檢測(cè)方法的建立57-59
• 5 結(jié)論59-60
• 參考文獻(xiàn)60-68
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況68-69
• 致謝69

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本文編號(hào)：740563