本文關(guān)鍵詞：民豬FoxN1基因序列及組織表達特征分析

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【摘要】：叉頭蛋白N1(Forkhead box protein N1,Fox N1)是翼狀螺旋/叉頭(Forkhead)轉(zhuǎn)錄因子家族成員,在胸腺遺傳網(wǎng)絡上占據(jù)重要位置。Fox N1基因是一個與胸腺發(fā)育及毛發(fā)生長相關(guān)的重要基因,它的缺失會導致嚴重的胸腺發(fā)育不健全,甚至是免疫缺陷。目前,針對民豬Fox N1基因序列的研究尚未出現(xiàn)報道。試驗旨在對民豬Fox N1基因的功能進行初步探究。利用常規(guī)PCR技術(shù)對民豬Fox N1基因進行克隆,包括FoxN1基因組序列的克隆以及完整編碼區(qū)序列的克隆。利用生物信息學手段對所獲得Fox N1基因完整編碼區(qū)序列進行分析,對民豬和大白豬的FoxN1基因編碼區(qū)序列進行比對,進而對遺傳變異位點進行分析。采用RT-PCR方法檢測Fox N1基因在所采集的各類組織樣品中的表達情況。以2月齡、4月齡、6月齡和8月齡的民豬為實驗材料,采用定量PCR檢測FoxN1在mRNA水平的轉(zhuǎn)錄情況,采用Western-blot檢測FoxN1在蛋白水平的翻譯情況。本實驗的研究結(jié)果如下:(1)成功克隆了民豬FoxN1基因組序列14 730bp。包括8個外顯子和7個內(nèi)含子。外顯子的位置從1到8分別是從1-123,518-976,3 732-3 842,5 512-5 642,7 800-7 896,11 390-11 597,11 746-12 237,14 411-14 730。(2)成功克隆了民豬FoxN1基因完整編碼區(qū)序列,大小為1 941 bp,編碼646個氨基酸,分子質(zhì)量為68.64 k Da,理論等電點為5.81。Fox N1蛋白位于細胞核內(nèi),不存在信號肽,不是分泌性蛋白質(zhì),不存在跨膜區(qū),在第269-347氨基酸處有1個叉頭結(jié)構(gòu)域,該蛋白在不同的物種間有高度的保守性。利用BLAST比對的方法獲得了42個物種的FoxN1基因編碼區(qū)序列,利用MEGA6.0軟件構(gòu)建了基于Fox N1基因序列的分子進化樹,發(fā)現(xiàn)民豬與牛、水牛、綿羊、藏羚羊等偶蹄目動物聚為一類,親緣關(guān)系較近其余物種也都符合物種進化規(guī)律,聚在不同的分支上。(3)成功構(gòu)建了pEGFP-N1-FoxN1-a/b/c質(zhì)粒,瞬時轉(zhuǎn)染PK15細胞,用熒光倒置顯微鏡觀察到Fox N1蛋白主要表達于細胞核中。(4)通過克隆發(fā)現(xiàn)了民豬Fox N1基因在胸腺組織的3種轉(zhuǎn)錄剪切變異體,符合可變剪切體的幾種形式。與變異體1相比,變異體2在第124-387核苷酸位置處發(fā)生缺失,序列大小為1 677bp,變異體3在581-582核苷酸位置處發(fā)生GCA插入,序列大小為1 944bp。(5)將民豬與大白豬的Fox N1基因完整編碼區(qū)序列進行比較,發(fā)現(xiàn)存在4個明顯突變位點,其中3個是同義突變,1個是錯義突變,并導致第108位的氨基酸發(fā)生了改變。(6)對民豬FoxN1基因在13個組織中進行表達檢測,結(jié)果表明其僅在皮膚、胸腺和舌上有顯著表達。(7)FoxN1基因在不同月齡的民豬胸腺組織進行熒光定量PCR操作,在4月齡的表達量顯著提高。(8)Fox N1基因在不同月齡的民豬胸腺組織進行Western-blot操作,在4月齡的表達量顯著提高。
【關(guān)鍵詞】：民豬 FoxN1基因 基因克隆 序列分析 表達
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S828
【目錄】：

• 摘要10-12
• 英文摘要12-14
• 1 前言14-22
• 1.1 Fox家族簡介14-17
• 1.1.1 Fox的染色體定位及基因組結(jié)構(gòu)14-15
• 1.1.2 Fox蛋白的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機制15
• 1.1.3 Fox蛋白的功能及其與疾病的關(guān)系15-16
• 1.1.4 Fox家族的展望16-17
• 1.2 Fox N1基因的研究進展17-19
• 1.2.1 Fox N1基因的簡介17
• 1.2.2 Fox N1的基因結(jié)構(gòu)和蛋白特征17
• 1.2.3 Fox N1基因的生物學功能17-18
• 1.2.4 Fox N1基因的研究進展18-19
• 1.3 生物信息學分析的研究進展19-21
• 1.3.1 生物信息學的背景19
• 1.3.2 生物數(shù)據(jù)庫介紹19-20
• 1.3.3 生物信息學數(shù)據(jù)分析工具20
• 1.3.4 生物信息學研究的主要內(nèi)容20-21
• 1.4 實驗目的和意義21-22
• 2 材料與方法22-33
• 2.1 材料22-24
• 2.1.1 實驗動物22
• 2.1.2 細胞株22
• 2.1.3 實驗試劑22
• 2.1.4 主要儀器設備22-23
• 2.1.5 緩沖液與主要試劑的配制23
• 2.1.6 主要生物學軟件23
• 2.1.7 相關(guān)生物信息學網(wǎng)址23-24
• 2.2 方法24-33
• 2.2.1 模板的制備24
• 2.2.2 民豬Fox N1基因組序列的克隆24-26
• 2.2.3 民豬Fox N1基因完整編碼區(qū)的克隆26-27
• 2.2.4 民豬與大白豬Fox N1基因編碼區(qū)序列的比對27
• 2.2.5 民豬Fox N1蛋白序列的生物信息學分析27-28
• 2.2.6 pEGFP-N1-Fox N1重組質(zhì)粒構(gòu)建28-29
• 2.2.7 細胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、檢測、亞細胞定位29
• 2.2.8 民豬Fox N1基因組織表達譜的構(gòu)建29-30
• 2.2.9 Real-Time PCR檢測民豬Fox N1基因30-31
• 2.2.10 Western Blot檢測民豬Fox N1表達規(guī)律31-33
• 3 結(jié)果與分析33-50
• 3.1 民豬FoxN1基因組序列擴增33
• 3.1.1 民豬基因組DNA的提取33
• 3.1.2 民豬Fox N1基因組序列擴增33
• 3.2 民豬FoxN1基因CDS區(qū)全長擴增33-34
• 3.3 民豬FoxN1基因的生物信息學分析34-40
• 3.3.1 蛋白質(zhì)氨基酸組成、分子量和等電點分析34
• 3.3.2 蛋白質(zhì)疏水性分析34
• 3.3.3 蛋白質(zhì)信號肽預測34-35
• 3.3.4 跨膜區(qū)預測35-36
• 3.3.5 亞細胞定位預測36
• 3.3.6 蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域預測36
• 3.3.7 同源性比對和分子系統(tǒng)發(fā)生分析36-40
• 3.4 民豬FoxN1基因的轉(zhuǎn)錄剪切變異體的發(fā)現(xiàn)及鑒別40
• 3.5 民豬與大白豬FoxN1基因編碼區(qū)序列的比對40-41
• 3.6 亞細胞定位41-44
• 3.6.1 pGM-T-Fox N1質(zhì)粒和pEGFP-N1質(zhì)粒雙酶切41-42
• 3.6.2 構(gòu)建pEGFP-N1-Fox N1重組質(zhì)粒42-43
• 3.6.3 瞬時轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Fox N1-a/b/c基因的定位結(jié)果43-44
• 3.7 民豬FoxN1基因在各組織中的擴增結(jié)果44-45
• 3.8 Real-Time PCR鑒定Fox N1基因在民豬胸腺各階段的表達45-48
• 3.8.1 標準曲線的建立45-47
• 3.8.2 Fox N1基因在胸腺組織的表達情況47-48
• 3.9 Western blot鑒定Fox N1蛋白在民豬胸腺各階段的表達48-50
• 3.9.1 BSA標準曲線的建立48
• 3.9.2 Western blot檢測Fox N1蛋白在民豬胸腺不同月齡的表達48-50
• 4 討論50-53
• 4.1 民豬FoxN1基因的克隆與生物信息學分析50
• 4.2 民豬FoxN1基因的可變剪接體50-51
• 4.3 民豬FoxN1基因的亞細胞定位51
• 4.4 民豬和大白豬Fox N1基因的序列比對51
• 4.5 民豬FoxN1基因的表達特異性分析51-53
• 5 結(jié)論53-54
• 致謝54-55
• 參考文獻55-60
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術(shù)論文60

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