本文關(guān)鍵詞：豬IGF1基因啟動(dòng)子活性分析及其表達(dá)調(diào)控的相關(guān)研究

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【摘要】：胰島素樣生長(zhǎng)因子1(Insulin-like growth factor 1,IGF1)是胰島素樣生長(zhǎng)因子(Insulin-like growth factors,IGFs)系統(tǒng)的成員之一,其在動(dòng)物生命活動(dòng)過程中發(fā)揮著重要的作用。研究表明,IGF1能介導(dǎo)動(dòng)物初生后生長(zhǎng)激素(GH)對(duì)生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用,而GH位于生長(zhǎng)軸的中心位置,是調(diào)節(jié)動(dòng)物生長(zhǎng)的主要激素。IGF1在許多細(xì)胞過程中發(fā)揮促有絲分裂的作用,體內(nèi)外試驗(yàn)也證明IGF1能促進(jìn)組織生長(zhǎng)并且參與組織代謝活動(dòng)。目前,已經(jīng)有大量關(guān)于畜禽IGF1基因?qū)ιL(zhǎng)速度和胴體性狀等影響的研究,研究證明血漿IGF1水平與生長(zhǎng)速度、采食量、胴體組成和肉質(zhì)性狀、繁殖性能等多種性狀相關(guān)。在畜禽中對(duì)IGF1基因的研究結(jié)果,對(duì)進(jìn)一步了解其作用機(jī)理和在動(dòng)物遺傳育種中進(jìn)行應(yīng)用打下良好的生物學(xué)基礎(chǔ)。以前關(guān)于IGF1基因的研究更多關(guān)注的是其基因組水平的DNA多態(tài)性與生長(zhǎng)及肉用性狀的相關(guān)關(guān)系,大量的研究也驗(yàn)證了一些與生產(chǎn)性能相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)。然而,生物個(gè)體的性狀差異主要還是由基因表達(dá)水平的差異所決定,研究基因表達(dá)水平的差異可能會(huì)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生性狀差異的主要原因。鑒于IGF1在動(dòng)物生命活動(dòng)過程中發(fā)揮重要的作用,認(rèn)清它的作用機(jī)理對(duì)人類了解和調(diào)節(jié)生命過程以及改良畜禽品種、提高生產(chǎn)效益具有十分重要的意義,本研究運(yùn)用啟動(dòng)子活性分析、ChIP、超表達(dá)、qRT-PCR等技術(shù),從轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平研究IGF1在豬成纖維細(xì)胞的表達(dá)調(diào)控機(jī)制,結(jié)果證實(shí)IGF1基因在豬成纖維細(xì)胞中可以是通過poly(dA:dT)tract、C/EBPα信號(hào)通路進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控。研究結(jié)果將有助于進(jìn)一步了解IGF1的分子調(diào)控機(jī)制,有助于深入了解其對(duì)豬生長(zhǎng)發(fā)育的作用機(jī)制,進(jìn)而為探索提高豬生長(zhǎng)效率的分子基礎(chǔ)提供重要依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1、克隆獲得了IGF1基因+1(以網(wǎng)上公布的mRNA序列的第一個(gè)堿基為+1)前面2775bp的5′調(diào)控區(qū)。2、成功構(gòu)建了豬IGF1基因啟動(dòng)子報(bào)告基因重組體,并轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞,結(jié)果表明,啟動(dòng)區(qū)-381/+2活性最高,同時(shí)推測(cè)在-381/-100區(qū)域存在順式作用元件。3、成功構(gòu)建了含不同基因型poly(dA:dT)tract的IGF1核心啟動(dòng)子的報(bào)告基因重組體,并轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞,結(jié)果表明,含有9-T、10-T、11-T的純合poly(dA:dT)tract的IGF1核心啟動(dòng)子的活性呈依次增加的趨勢(shì),且含11-T的純合poly(dA:dT)tract的IGF1核心啟動(dòng)子的活性顯著高于含9-T、10-T的純合poly(dA:dT)tract的IGF1核心啟動(dòng)子的活性(P0.05);而含12-T的純合poly(dA:dT)tract的IGF1核心啟動(dòng)子的活性明顯地減少,顯著低于含11-T的純合poly(dA:dT)tract的IGF1核心啟動(dòng)子的活性(P0.01)。4、通過共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-C/EBPα和含不同基因型poly(dA:dT)tract的IGF1核心啟動(dòng)子的報(bào)告基因重組體,結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)染后各IGF1啟動(dòng)子活性顯著低于各同基因型而沒有共轉(zhuǎn)染的IGF1啟動(dòng)子活性,表明轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα對(duì)含不同基因型poly(dA:dT)tract的IGF1基因的表達(dá)均具有負(fù)調(diào)控作用,而且共轉(zhuǎn)染后各基因型IGF1啟動(dòng)子的活性相似,表明不同基因型的poly(dA:dT)tract對(duì)C/EBPα調(diào)控IGF1基因表達(dá)產(chǎn)生一定的影響,其中含11-T的IGF1基因的活性變化最顯著,其次為含10-T的,再到含9-T、12-T的,其變化的程度與不同基因型的poly(dA:dT)tract對(duì)IGF1啟動(dòng)子活性的影響一致;超表達(dá)C/EBPα后,能夠顯著地抑制IGF1的轉(zhuǎn)錄,也表明C/EBPα對(duì)IGF1的轉(zhuǎn)錄具有較好的負(fù)調(diào)控功能。5、采用ChIP技術(shù),證實(shí)C/EBPα可通過與IGF1啟動(dòng)子區(qū)-286和-1254位點(diǎn)的C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,參與IGF1基因的表達(dá)調(diào)控,從而抑制IGF1的表達(dá)。結(jié)合啟動(dòng)子活性分析結(jié)果,核心啟動(dòng)子-381/-100區(qū)域?qū)GF1的表達(dá)起基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄作用,而C/EBPα則抑制IGF1的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：豬 IGF1 啟動(dòng)子 Poly(dA:dT)tract C/EBPα
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S828
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 英文縮寫詞8-13
• 1 前言13-26
• 1.1 養(yǎng)豬業(yè)的重要性13
• 1.2 IGF1基因的研究進(jìn)展13-18
• 1.2.1 IGF1的研究歷史13-14
• 1.2.2 IGF1基因的結(jié)構(gòu)及定位14
• 1.2.3 IGF1基因的生物學(xué)功能14-15
• 1.2.3.1 IGF1促生長(zhǎng)作用14-15
• 1.2.3.2 IGF1對(duì)胚胎發(fā)育的作用15
• 1.2.4 IGF1基因的表達(dá)量15-16
• 1.2.5 IGF1基因的多態(tài)性16-17
• 1.2.6 IGF1的調(diào)控17-18
• 1.2.6.1 IGFBPs的調(diào)控17-18
• 1.2.6.2 激素對(duì)IGF1的調(diào)控18
• 1.3 Poly(dA:dT) tract的研究進(jìn)展18-22
• 1.3.1 Poly(dA:dT) tracts在體內(nèi)的重要功能18-19
• 1.3.2 Poly(dA:dT) tracts在體內(nèi)排斥核小體19-20
• 1.3.3 Poly(dA:dT) tracts擁有不尋常的結(jié)構(gòu)與動(dòng)態(tài)特性20-22
• 1.4 轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα的研究進(jìn)展22-25
• 1.4.1 C/EBPs的研究歷史22-24
• 1.4.2 C/EBPα的調(diào)控機(jī)理24-25
• 1.5 研究目的及意義25
• 1.6 本研究的技術(shù)路線25-26
• 2 材料與方法26-52
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料26-31
• 2.1.1 供試樣品26
• 2.1.2 主要儀器與設(shè)備26-27
• 2.1.3 主要試劑來源和配制27-30
• 2.1.3.1 酶類、試劑和試劑盒27
• 2.1.3.2 試劑的配置27-30
• 2.1.4 細(xì)胞株、菌株和質(zhì)粒30
• 2.1.5 主要分子生物學(xué)軟件與數(shù)據(jù)庫30-31
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法31-52
• 2.2.1 基因組DNA和總RNA抽提31-33
• 2.2.1.1 基因組DNA的抽提31
• 2.2.1.2 總RNA抽提31-32
• 2.2.1.3 總RNA的DNase-Ⅰ處理32
• 2.2.1.4 總RNA檢測(cè)及濃度測(cè)定32-33
• 2.2.2 總RNA反轉(zhuǎn)錄33
• 2.2.3 豬IGF1基因 5′調(diào)控區(qū)克隆33-38
• 2.2.3.1 豬IGF1基因 5′調(diào)控區(qū)擴(kuò)增34
• 2.2.3.2 目的片段的回收和純化34-36
• 2.2.3.3 目的片段的T載體克隆36-37
• 2.2.3.4 T-IGF1的質(zhì)粒抽提37-38
• 2.2.4 豬IGF1基因啟動(dòng)子報(bào)告基因重組體的構(gòu)建及活性分析38-44
• 2.2.4.1 啟動(dòng)子 5′端系列缺失報(bào)告基因重組體的構(gòu)建38-40
• 2.2.4.2 豬IGF1基因缺失片段的PCR擴(kuò)增40
• 2.2.4.3 各缺失片段PCR產(chǎn)物的回收40
• 2.2.4.4 缺失片段PCR產(chǎn)物和pGL3-basic載體雙酶切40-41
• 2.2.4.5 酶切產(chǎn)物回收41
• 2.2.4.6 酶切產(chǎn)物的連接41
• 2.2.4.7 酶切連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化41
• 2.2.4.8 無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提方法41-42
• 2.2.4.9 各重組質(zhì)粒純化與檢測(cè)42
• 2.2.4.10 豬胎兒成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的建立42-43
• 2.2.4.11 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染43-44
• 2.2.4.12 熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)44
• 2.2.5 含不同基因型poly(dA:dT) tract的IGF1核心啟動(dòng)子的報(bào)告基因重組體的構(gòu)建及活性分析44-45
• 2.2.5.1 含不同基因型poly(dA:dT) tract的IGF1核心啟動(dòng)子的報(bào)告基因重組體的構(gòu)建44
• 2.2.5.2 含不同基因型poly(dA:dT) tract的IGF1核心啟動(dòng)子片段的PCR擴(kuò)增44-45
• 2.2.5.3 各啟動(dòng)子片段PCR產(chǎn)物的回收45
• 2.2.5.4 各啟動(dòng)子片段PCR產(chǎn)物和pGL3-basic載體雙酶切45
• 2.2.5.5 酶切產(chǎn)物回收45
• 2.2.5.6 酶切產(chǎn)物的連接45
• 2.2.5.7 酶切連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化45
• 2.2.5.8 無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提45
• 2.2.5.9 豬胎兒成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的建立45
• 2.2.5.10 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染45
• 2.2.5.11 熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)45
• 2.2.6 豬IGF1基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子鑒定45-52
• 2.2.6.1 C/EBPα超表達(dá)載體的構(gòu)建45-52
• 2.2.6.1.1 引物設(shè)計(jì)及合成45-46
• 2.2.6.1.2 目的片段的回收和純化46
• 2.2.6.1.3 PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1 載體雙酶切46
• 2.2.6.1.4 酶切產(chǎn)物的回收46
• 2.2.6.1.5 酶切產(chǎn)物的連接46
• 2.2.6.1.6 酶切連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化46-47
• 2.2.6.1.7 無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提47
• 2.2.6.1.8 豬胎兒成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的建立47
• 2.2.6.1.9 pcDNA3.1- C/EBPα與含不同基因型poly(dA:dT) tract的P5報(bào)告基因重組體共轉(zhuǎn)染47
• 2.2.6.1.10 超表達(dá)后mRNA水平的檢測(cè)47-48
• 2.2.6.1.11 定量結(jié)果的數(shù)據(jù)分析處理48
• 2.2.6.1.12 C/EBPα干擾實(shí)驗(yàn)48-49
• 2.2.6.1.13 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)49-52
• 3 結(jié)果與分析52-64
• 3.1 DNA提取結(jié)果52-53
• 3.2 總RNA提取結(jié)果53
• 3.3 豬IGF15′調(diào)控區(qū)序列獲得53-54
• 3.4 豬IGF1基因啟動(dòng)子報(bào)告基因重組體的構(gòu)建及活性分析54-58
• 3.4.1 豬IGF1基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)54-55
• 3.4.2 啟動(dòng)子報(bào)告基因重組體的構(gòu)建55
• 3.4.3 豬原代胎兒成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)55-57
• 3.4.4 啟動(dòng)子活性分析57-58
• 3.5 含不同基因型poly(dA:dT) tract的IGF1核心啟動(dòng)子的活性分析58
• 3.6 豬IGF1基因核轉(zhuǎn)錄因子鑒定58-64
• 3.6.1 C/EBPα超表達(dá)載體構(gòu)建58-59
• 3.6.2 pcDNA3.1-C/EBPα與含不同基因型poly(dA:dT) tract的P5報(bào)告基因重組體共轉(zhuǎn)染59-60
• 3.6.3 pcDNA3.1-C/EBPα的超表達(dá)60-61
• 3.6.4 C/EBPα干擾實(shí)驗(yàn)61-63
• 3.6.5 IGF1基因啟動(dòng)子ChIP檢測(cè)結(jié)果63-64
• 4 討論與結(jié)論64-77
• 4.1 IGF1基因?qū)?dòng)物機(jī)體的作用64
• 4.2 豬IGF1基因 5′調(diào)控區(qū)序列的獲得64-65
• 4.3 豬IGF1基因啟動(dòng)子活性分析65-68
• 4.3.1 豬IGF1基因 5′調(diào)控區(qū)重要調(diào)控元件分析65-67
• 4.3.2 豬IGF1基因啟動(dòng)子活性分析67-68
• 4.4 Poly(dA:dT) tract對(duì)IGF1基因的調(diào)控68-71
• 4.5 C/EBPα對(duì)IGF1基因的調(diào)控71-73
• 4.6 Poly(dA:dT) tract對(duì)C/EBPα調(diào)控IGF1基因的影響73-75
• 4.7 結(jié)論75-77
• 致謝77-78
• 參考文獻(xiàn)78-92
• 附錄92-93

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：738651