本文關(guān)鍵詞：豬源乳酸菌分離鑒定及初步應(yīng)用

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【摘要】：本研究從雅安規(guī)模化豬場(chǎng)10日齡內(nèi)健康仔豬糞便中分離并篩選出耐酸、耐膽鹽、耐胰酶且產(chǎn)酸能力強(qiáng)的優(yōu)良乳酸菌菌株,闡明了乳酸菌的抑菌機(jī)理和抑菌條件,成功研制出了適合生產(chǎn)上用于預(yù)防和治療哺乳仔豬細(xì)菌性腹瀉、改善仔豬斷乳應(yīng)激反應(yīng)、促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)和降低料肉比的優(yōu)良乳酸菌制劑。對(duì)分離得到的13株乳酸菌進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌學(xué)和16S rRNA方法進(jìn)行鑒定,確定YW-1、4、6、8和10株為唾液乳桿菌唾液亞種,YW-2、3、5、7、9、11和12株為唾液乳桿菌水楊素亞種,H109株為嗜酸乳桿菌。通過(guò)低酸性環(huán)境、高膽鹽濃度和高胰蛋白酶條件下的生長(zhǎng)存活試驗(yàn)及產(chǎn)酸能力鑒定試驗(yàn),最終篩選出能在pH2.0酸性環(huán)境、0.3%膽鹽和1.4%胰蛋白酶中存活,且產(chǎn)酸能力強(qiáng)的YW-7、YW-1和H1093株菌作為后續(xù)試驗(yàn)用菌株。乳酸菌與大腸桿菌混合培養(yǎng)體外抑菌試驗(yàn)證實(shí),乳酸菌的抑菌作用具有種屬、活菌濃度和pH值依賴性,其中,YW-7培養(yǎng)液的pH值降低速率最快,最低pH值可達(dá)3.29,抑菌能力最強(qiáng),YW-1次之,H109最差。YW-7與大腸桿菌的菌液體積比為1：1、2：1和4：1混合培養(yǎng)時(shí),分別在12 h、8h和4h時(shí)呈現(xiàn)完全抑制大腸桿菌生長(zhǎng)的作用。在牛津杯法抑菌試驗(yàn)中,YW-7發(fā)酵上清液對(duì)大腸桿菌的抑制作用最強(qiáng),抑菌圈直徑可達(dá)13.08～20.14 mm,而YW-1和H109的抑菌作用較差,僅為12.32～18.24 mm和11.24～17.32 mm。此外,相同pH值的HCl對(duì)大腸桿菌無(wú)抑制作用,抑菌圈均為0；當(dāng)HCl的pH值調(diào)至3.00時(shí),對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑也僅為9.56 mm,抑菌效果遠(yuǎn)低于乳酸菌發(fā)酵上清液。這一結(jié)果表明,酸性環(huán)境有助于乳酸菌發(fā)揮其抑菌作用,但并非抑菌的唯一因素。氣相色譜檢測(cè)菌株產(chǎn)生有機(jī)酸的試驗(yàn)結(jié)果顯示,分離的乳酸菌菌株能產(chǎn)生乳酸、苯乳酸、硬脂酸、脯氨酸、丙氨酸、乙酸、亮氨酸、甘氨酸、棕櫚酸和維生素C,在產(chǎn)乳酸和苯乳酸性能上,YW-7YW-1H109。研究發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)24 h內(nèi),乳酸菌培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng),培養(yǎng)液中乳酸和苯乳酸的含量越高。YW-7培養(yǎng)至24 h時(shí),培養(yǎng)液中乳酸和苯乳酸的含量分別可達(dá)14.52 mg/mL和1.47 mg/mL o由于YW-7具有良好的產(chǎn)酸性能,故選擇其作為后續(xù)生產(chǎn)應(yīng)用研究的試驗(yàn)菌株。YW-7制作的乳酸菌制劑用于治療和預(yù)防哺乳仔豬細(xì)菌性腹瀉,其效果與抗生素相當(dāng),2-3天即可痊愈,而市售產(chǎn)品產(chǎn)品Ⅰ和產(chǎn)品Ⅱ均未表現(xiàn)出顯著的預(yù)防效果,3組的腹瀉率分別為7.15%、7.95%和12.2%,空白對(duì)照組為7%。3種微生態(tài)制劑灌喂哺乳仔豬10天后,YW-7組糞便中乳酸菌與大腸桿菌數(shù)量比極顯著高于產(chǎn)品Ⅰ組、產(chǎn)品Ⅱ組和抗生素組(P0.01)；其增重率為103.57%,同樣極顯著高于產(chǎn)品Ⅰ組、產(chǎn)品Ⅱ組和抗生素組(P0.01)。試驗(yàn)結(jié)果證明,YW-7能有效治療哺乳仔豬細(xì)菌性腹瀉,顯著改善仔豬的腸道環(huán)境并促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)。斷乳仔豬連續(xù)飼喂YW-7乳酸菌制劑15天后,無(wú)腹瀉發(fā)生,而產(chǎn)品Ⅰ組、產(chǎn)品Ⅱ組和空白組分別為3%、7%和8.3%；同時(shí),YW-7組仔豬增重率均極顯著高于產(chǎn)品Ⅰ組、產(chǎn)品Ⅱ組和空白組(P0.01),料肉比僅為1.28,顯著低于產(chǎn)品Ⅰ組、產(chǎn)品Ⅱ組和空白組的1.49、2.34和2.14(P0.05)。YW-7組試驗(yàn)豬只在飼喂至100天屠宰時(shí),平均體重比其它3組高出5 kg左右。以上試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,YW-7菌株制備的乳酸菌制劑能預(yù)防仔豬斷奶應(yīng)激所造成的腹瀉,尤其是能顯著的促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)并極大地降低料肉比。
【關(guān)鍵詞】：乳酸菌 抑菌機(jī)理 仔豬 腹瀉 增重
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 1 前言11-17
• 1.1 斷乳仔豬消化道生理特點(diǎn)11-12
• 1.1.1 胃酸分泌不足,消化酶活性較低11
• 1.1.2 腸絨膜形態(tài)發(fā)生變化,吸收能力下降11
• 1.1.3 胃腸道微生物區(qū)系紊亂,容易發(fā)生腹瀉11-12
• 1.2 仔豬腹瀉發(fā)病機(jī)理和現(xiàn)狀12
• 1.3 防治斷乳仔豬腹瀉的方法12-13
• 1.4 常見(jiàn)乳酸菌的分類(lèi)13
• 1.5 乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸13-15
• 1.5.1 有機(jī)酸種類(lèi)及抑菌作用13-14
• 1.5.2 有機(jī)酸抑菌作用機(jī)理14-15
• 1.6 乳酸菌在防治仔豬腹瀉方面的應(yīng)用15-16
• 1.7 乳酸菌制劑存在的問(wèn)題16-17
• 1.7.1 產(chǎn)品的安全性、有效性16
• 1.7.2 產(chǎn)品單一,缺乏針對(duì)性16
• 1.7.3 產(chǎn)品不能與抗生素聯(lián)用16
• 1.7.4 生產(chǎn)加工保存穩(wěn)定性16-17
• 1.8 本研究的目的及意義17
• 2 試驗(yàn)材料17-18
• 2.1 試驗(yàn)樣品、指示菌株及試驗(yàn)動(dòng)物17
• 2.2 主要試劑及藥品17-18
• 2.3 試驗(yàn)儀器18
• 3 試驗(yàn)方法18-26
• 3.1 乳酸菌的分離鑒定及優(yōu)良乳酸菌菌株的篩選18-20
• 3.1.1 乳酸菌的分離18-19
• 3.1.2 乳酸菌的初步鑒定19
• 3.1.3 16S rDNA序列分析19-20
• 3.1.4 優(yōu)良乳酸菌菌株的篩選20
• 3.2 乳酸菌抑制大腸桿菌生長(zhǎng)繁殖的研究20-23
• 3.2.1 菌株的活化及培養(yǎng)20-21
• 3.2.2 自制培養(yǎng)基的篩選21-22
• 3.2.3 乳酸菌對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌生長(zhǎng)繁殖的抑制22
• 3.2.4 乳酸菌發(fā)酵上清液對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)繁殖的抑制22-23
• 3.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析發(fā)酵上清液中主要有機(jī)酸含量23-24
• 3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)液和發(fā)酵上清液的預(yù)處理23
• 3.3.2 色譜條件23
• 3.3.3 質(zhì)譜條件23
• 3.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備23
• 3.3.5 發(fā)酵上清液分析23-24
• 3.4 乳酸菌制劑應(yīng)用效果的研究24-26
• 3.4.1 乳酸菌制劑制備和保存期試驗(yàn)24
• 3.4.2 乳酸菌預(yù)防和治療哺乳仔豬腹瀉、改善腸道菌群及促生長(zhǎng)試驗(yàn)24-25
• 3.4.3 乳酸菌預(yù)防斷乳仔豬腹瀉及促生長(zhǎng)試驗(yàn)25-26
• 4 試驗(yàn)結(jié)果26-48
• 4.1 乳酸菌的分離鑒定及優(yōu)良乳酸菌菌株的篩選26-32
• 4.1.1 分離細(xì)菌的形態(tài)、染色及菌落形態(tài)26-27
• 4.1.2 生理生化特性觀察27-28
• 4.1.3 16S rRNA鑒定28-29
• 4.1.4 耐酸試驗(yàn)29-30
• 4.1.5 耐膽鹽試驗(yàn)30-31
• 4.1.6 耐胰酶試驗(yàn)31-32
• 4.1.7 分離菌產(chǎn)酸試驗(yàn)32
• 4.2 乳酸菌體外抑制產(chǎn)腸毒素大腸桿菌生長(zhǎng)試驗(yàn)32-39
• 4.2.1 自制培養(yǎng)基的篩選32-35
• 4.2.2 乳酸菌與大腸桿菌混合培養(yǎng)35-39
• 4.2.3 乳酸菌發(fā)酵上清液抑制大腸桿菌生長(zhǎng)試驗(yàn)39
• 4.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析發(fā)酵上清液中乳酸和苯乳酸含量39-46
• 4.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜分析結(jié)果39-40
• 4.3.2 乳酸和苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線40-41
• 4.3.3 乳酸菌發(fā)酵上清液中主要有機(jī)酸含量測(cè)定41-46
• 4.4 乳酸菌制劑保存期試驗(yàn)46
• 4.5 乳酸菌制劑應(yīng)用效果46-48
• 4.5.1 乳酸菌制劑預(yù)防和治療哺乳仔豬細(xì)菌性腹瀉、改道菌群及促生長(zhǎng)效果46-47
• 4.5.2 乳酸菌預(yù)防斷乳仔豬腹瀉及促生長(zhǎng)效果47-48
• 5 分析討論48-54
• 5.1 乳酸菌的分離鑒定及優(yōu)良乳酸菌菌株的篩選48-50
• 5.1.1 乳酸菌的分離鑒定48
• 5.1.2 優(yōu)良乳酸菌菌株的篩選48-50
• 5.2 乳酸菌對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌生長(zhǎng)繁殖的抑制50-51
• 5.2.1 混合培養(yǎng)中乳酸菌對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的抑制50-51
• 5.2.2 乳酸菌發(fā)酵上清液對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的抑制作用51
• 5.3 乳酸菌抑菌物質(zhì)的檢測(cè)51-52
• 5.4 乳酸菌制劑生產(chǎn)應(yīng)用效果評(píng)價(jià)52-54
• 5.4.1 乳酸菌制劑的保存52
• 5.4.2 乳酸菌預(yù)防和治療哺乳仔豬細(xì)菌性腹瀉、改善腸道菌群及促生長(zhǎng)效果52-53
• 5.4.3 乳酸菌制劑預(yù)防斷乳仔豬細(xì)菌性腹瀉及促生長(zhǎng)效果53-54
• 6 結(jié)論54
• 7 創(chuàng)新性54-55
• 參考文獻(xiàn)55-63
• 致謝63-64
• 附錄64-76

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：738712