發(fā)布時(shí)間：2017-08-25 22:17

  本文關(guān)鍵詞：田鼠巴貝斯蟲過氧化物氧化還原酶Prx1和Prx的鑒定及功能分析

  更多相關(guān)文章： 田鼠巴貝斯蟲 過氧化物氧化還原蛋白 原核表達(dá) 酶活性分析

【摘要】：最近幾年,田鼠巴貝斯蟲(Babesia microti)已成為一個(gè)新型的人類病原體,也是世界上的許多地區(qū)人類巴貝斯蟲病的主要病原體。蟲體內(nèi)的過氧化物氧化還原酶(Peroxiredoxins,Prxs)是細(xì)胞中一類表達(dá)豐富的蛋白質(zhì)。Prxs蛋白家族和其它抗氧化蛋白酶,如SOD,Gpx,Trx及Trx R一樣在保護(hù)蟲體內(nèi)的生物大分子免受不利因素的影響方面發(fā)揮著重要作用。Prxs還原過氧化氫主要依賴其高度保守的具有氧化還原活性的Cys。Prxs蛋白被劃分為Prx1,Prx5,Prx6,TPX,Prx Q和Ahp E六個(gè)亞科,本實(shí)驗(yàn)中研究的是其中的Prx1和Prx Q。雖然這種寄生蟲的Prxs基因組已被測序和注釋,但其生物性特性尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過分子生物學(xué)技術(shù)獲得了Prx1和Prx Q全長序列基因,其中Prx1全基因序列長度為594bp,具有一個(gè)編碼194個(gè)氨基酸的開放閱讀框(ORF),該蛋白無信號肽,利用軟件推測Prx1的蛋白大小約為23 k Da。Prx Q全基因序列長度為537bp,具有一個(gè)編碼194個(gè)氨基酸的ORF,其ORF中有一個(gè)信號肽序列,利用軟件推測Prx Q的蛋白大小約為21 k Da。我們也成功構(gòu)建了以p ET-30a為載體的重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞中的原核表達(dá)系統(tǒng)。通過對誘導(dǎo)條件的摸索,確定在1m M IPTG誘導(dǎo),200rpm,37℃搖床振蕩培養(yǎng)12h時(shí)能獲得大量的重組蛋白,并通過Prx1和Prx Q上清進(jìn)一步純化獲得了純度較高的重組蛋白,符合進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的要求。Prx1和Prx Q重組蛋白活性分析表明證明Prx1和Prx Q蛋白都有活性,但Prx1蛋白活性更高。在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)我們發(fā)現(xiàn),Prx Q的序列中有一段信號肽,可能這決定了Prx1和Prx Q在細(xì)胞中的分布位置不同,從而使兩種蛋白發(fā)揮不同的功能。關(guān)于田鼠巴貝斯蟲各種Prxs的具體作用,需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步研究。另外,通過Western blot鑒定和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IFAT)分析證明已經(jīng)成功制備了Prx1和Prx Q多抗血清,同時(shí)Western blot鑒定證明蟲體Prx1和Prx Q天然蛋白在蟲體中以單體的形式發(fā)揮抗氧化作用,且蟲體在紅細(xì)胞中分裂高峰時(shí)Prx1和Prx Q大量表達(dá)。IFAT證明Prx1和Prx Q天然蛋白大量存在與細(xì)胞漿中。本文以B.microti Prxs為重點(diǎn),解析其生物學(xué)特征及功能,展望了B.microti Prxs的研究和應(yīng)用前景,以期為研究B.microti的致病機(jī)理及研發(fā)原蟲病疫苗提供參考,并為更深入的研究提供依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：田鼠巴貝斯蟲 過氧化物氧化還原蛋白 原核表達(dá) 酶活性分析
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.7
【目錄】：

• 符號說明4-8
• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 1.引言12-17
• 1.1 田鼠巴貝斯蟲過氧化物氧化還原酶（Prxs）的研究進(jìn)展12-17
• 1.1.1 Prxs的結(jié)構(gòu)與分類13-14
• 1.1.2 Prxs作用機(jī)制14-15
• 1.1.3 Prx的功能15-16
• 1.1.4 小結(jié)16-17
• 2 材料與方法17-37
• 2.1 試驗(yàn)材料17
• 2.2 主要試劑和儀器17-18
• 2.2.1 主要試劑17-18
• 2.2.2 主要儀器18
• 2.3 主要相關(guān)試劑配方18-24
• 2.3.1 基因克隆相關(guān)試劑配方18-20
• 2.3.2 SDS-PAGE相關(guān)試劑配方20-21
• 2.3.3 蛋白純化相關(guān)試劑配方21-23
• 2.3.4 ELISA相關(guān)試劑配方23-24
• 2.3.5 提取RNA的相關(guān)試劑配方24
• 2.4 實(shí)驗(yàn)方法24-37
• 2.4.1 Prx1和Prx Q基因的克隆24-28
• 2.4.1.1 收集KM小白鼠紅細(xì)胞中的田鼠巴貝斯蟲蟲體24-25
• 2.4.1.2 田鼠巴貝斯蟲總RNA的提取25
• 2.4.1.3 田鼠巴貝斯蟲總RNA的反轉(zhuǎn)錄25-26
• 2.4.1.4 Prx1和Prx Q保守片段的擴(kuò)增26-27
• 2.4.1.4.1 引物設(shè)計(jì)26
• 2.4.1.4.2 Prx1和Prx Q保守片段的擴(kuò)增26-27
• 2.4.1.5 PCR產(chǎn)物的膠回收純化27-28
• 2.4.1.6 膠回收產(chǎn)物的連接和轉(zhuǎn)化28
• 2.4.2 Prx1和Prx Q的原核表達(dá)28-33
• 2.4.2.1 構(gòu)建重組質(zhì)粒28-30
• 2.4.2.1.1 Prx1/p MD-18T、Prx Q/p MD-18T和p ET-30a空質(zhì)粒的提取28-29
• 2.4.2.1.2 插入片段的擴(kuò)增29-30
• 2.4.2.2 重組蛋白表達(dá)形式分析30-33
• 2.4.2.2.1 IPTG的誘導(dǎo)表達(dá)30
• 2.4.2.2.2 SDS-PAGE鑒定重組蛋白30-32
• 2.4.2.2.3 蛋白純化32-33
• 2.4.3 多抗血清的制備33
• 2.4.4 抗體水平檢測33-34
• 2.4.5 制備血涂片34
• 2.4.6 重組蛋白的表達(dá)鑒定34-36
• 2.4.6.1 重組蛋白的Western Blot鑒定34-35
• 2.4.6.2 重組蛋白的間接免疫熒光檢測35-36
• 2.4.7 酶活性分析試驗(yàn)36-37
• 2.4.7.1 質(zhì)粒保護(hù)試驗(yàn)36-37
• 2.4.7.2 硫氰酸鐵法測Prx1催化H2O2的反應(yīng)活性37
• 2.4.7.3 Prx抗氧化活性測定37
• 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-47
• 3.1 Prx1和Prx Q基因的克隆37-39
• 3.1.1 總RNA的提取37-38
• 3.1.2 保守片段的擴(kuò)增38-39
• 3.2 Prx1和Prx Q的原核表達(dá)39-42
• 3.2.1 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建39-40
• 3.2.2 蛋白上清純化40-41
• 3.2.3 抗體水平檢測41-42
• 3.3 重組蛋白的表達(dá)鑒定42-44
• 3.3.1 重組蛋白的Western Blot鑒定42
• 3.3.2 重組蛋白的間接免疫熒光檢測42-44
• 3.4 質(zhì)粒保護(hù)試驗(yàn)44-45
• 3.5 硫酸氫鐵法催化過氧化氫45-46
• 3.6 Prx抗氧化活性測定46-47
• 4 討論47-51
• 5 總結(jié)51-52
• 參考文獻(xiàn)52-57
• 致謝57

【相似文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王中華;田鼠巴貝斯蟲過氧化物氧化還原酶Prx1和Prx的鑒定及功能分析[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

，

本文編號：738440