本文關(guān)鍵詞：CaMKⅡ在鎘致原代大鼠成骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑中的作用

  更多相關(guān)文章： 鎘 成骨細胞 細胞凋亡 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激

【摘要】：鎘作為廣泛存在的重金屬污染物,通常以鎘離子的形式通過鈣離子泵、離子通道型受體等進入細胞,進而影響胞內(nèi)鈣離子分布。胞內(nèi)鈣離子濃度改變引起CaMK Ⅱ表達水平的變化以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應。而CaMK Ⅱ在成骨細胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激中的作用鮮有報道。為了研究鎘致鈣穩(wěn)態(tài)失衡引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激產(chǎn)生的影響,原代成骨細胞暴露于鎘及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子通道抑制劑2-APB,流式細胞術(shù)測定細胞內(nèi)鈣離子濃度,RTCA檢測細胞存活率,蛋白免疫印跡法檢測UPR相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果表明2 μmol/L醋酸鎘、50μmol/L 2-APB及其共處理成骨細胞后,與對照組相比,鎘處理導致細胞存活率顯著降低,且伴隨著細胞內(nèi)鈣離子濃度升高(P0.01); 2-APB與鎘共處理組和鎘處理組相比,細胞內(nèi)鈣離子濃度顯著降低(P＜0.01)；不同濃度的醋酸鎘(0、0.25、0.5、1、2、5、10μmol/L)處理6h或2μmol/L醋酸鎘處理成骨細胞不同時間(0、0.5、1、5、10、30 min或2、4、6 h)后,與對照組相比,2μmol/L醋酸鎘處理成骨細胞6小時能顯著提高BiP、ATF4、CHOP三個蛋白的表達水平(P)＜0.05或P＜0.01)。為了研究鎘對成骨細胞CaMKⅡ表達的影響及CaMKⅡ在鎘致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激中的作用,原代成骨細胞暴露于鎘、2-APB或CaMKⅡ抑制劑KN93, RTCA檢測細胞存活率,蛋白免疫印跡法檢測CaMKⅡ、P-CaMKⅡ和UPR相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果表明與對照組相比,2μmol/L醋酸鎘處理成骨細胞6小時能顯著提高CaMKⅡ的磷酸化水平；與鎘處理組相比,2-APB與鎘共處理組顯著降低CaMKⅡ的磷酸化水平;而KN93與鎘共處理組顯著提高細胞存活率,且顯著降低了ATF4和CHOP蛋白的表達(P＜0.05或P＜0.01)。為了研究鎘致成骨細胞凋亡的過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和CaMKⅡ的作用,成骨細胞暴露于鎘、2-APB或KN93,流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率,雙苯酰亞胺(Hoechst 33258)染色觀察細胞核形態(tài),蛋白免疫印跡法檢測Caspase-12、3, Bax和Bcl-2蛋白的表達。結(jié)果表明2 μmol/L鎘暴露成骨細胞6h后,細胞凋亡率、Caspase-12、3蛋白活化水平和Bax/Bcl-2水平極顯著高于對照組(P0.01); 2-APB與鎘共處理組以及KN93與鎘共處理組細胞凋亡率、Caspase-12、3蛋白活化水平和Bax/Bcl-2水平極顯著低于鎘處理組(P0.01); Hoechst 33258染色結(jié)果與上述一致。綜上所述,鎘通過引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子造成胞漿鈣超載,誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應,最后通過Caspase-12、3以及BCL-2家族蛋白途徑導致原代大鼠成骨細胞凋亡；CaMKⅡ參與這個過程并發(fā)揮重要作用。
【關(guān)鍵詞】：鎘 成骨細胞 細胞凋亡 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.3
【目錄】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-6
• 縮略表6-11
• 第一部分 文獻綜述11-26
• 第一章 鎘致骨骼毒性的研究進展11-16
• 1. 鎘致骨骼毒性的流行病學研究11-12
• 2. 鎘致骨毒性的機制12-16
• 2.1 鎘間接致骨毒性12-13
• 2.2 鎘直接致骨毒性13-14
• 2.3 鎘致骨毒性與其他微量元素的關(guān)系14-16
• 第二章 細胞凋亡中鎘和鈣的相互作用16-21
• 1. 鎘與鈣及其相關(guān)蛋白16-19
• 1.1 鎘與鈣穩(wěn)態(tài)16-17
• 1.2 鎘對鈣調(diào)蛋白的作用17-18
• 1.3 鎘對CaMKⅡ的作用18-19
• 2. 鎘與細胞凋亡19-21
• 2.1 鎘對細胞凋亡的影響19
• 2.2 鎘對鈣蛋白酶的影響19
• 2.3 鈣調(diào)蛋白在細胞凋亡中的作用19-21
• 第三章 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在細胞凋亡過程中的作用21-25
• 1. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與細胞凋亡21-22
• 2. 鎘誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激22-23
• 3. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和UPR調(diào)節(jié)鎘誘導的細胞凋亡23-25
• 本研究的目的與意義25-26
• 第二部分 試驗研究26-63
• 第一章 鎘致成骨細胞鈣超載及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)失衡引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激26-34
• 1. 材料26-27
• 1.1 實驗動物26
• 1.2 主要儀器26-27
• 1.3 主要試劑及材料27
• 2. 方法27-29
• 2.1 溶液配制27
• 2.2 SD大鼠成骨細胞的準備27-28
• 2.2.1 成骨細胞的分離培養(yǎng)27-28
• 2.2.2 成骨細胞的消化傳代28
• 2.3 細胞存活率監(jiān)測28
• 2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)游離鈣離子濃度28
• 2.5 免疫印跡檢測成骨細胞中BiP、ATF4、CHOP蛋白表達28-29
• 2.5.1 細胞處理28-29
• 2.5.2 蛋白樣品制備29
• 2.5.3 免疫印跡29
• 2.6 數(shù)據(jù)分析29
• 3. 結(jié)果29-33
• 3.1 鎘對細胞存活率、細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響及2-APB的保護效應29-31
• 3.2 鎘對原代大鼠成骨細胞UPR蛋白表達的影響31-33
• 3.2.1 鎘暴露不同時間段對細胞UPR蛋白表達的影響31
• 3.2.2 不同濃度鎘對原代大鼠成骨細胞UPR蛋白表達的影響31-33
• 4. 討論33-34
• 第二章 鎘致成骨細胞CaMKⅡ表達水平變化及其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激中的作用34-40
• 1. 材料34
• 1.1 實驗動物34
• 1.2 主要儀器34
• 1.3 主要試劑及材料34
• 2. 方法34-35
• 2.1 細胞培養(yǎng)34
• 2.2 免疫印跡檢測成骨細胞中CaMKⅡ、BiP、ATF4、CHOP蛋白表達34
• 2.3 數(shù)據(jù)分析34-35
• 3. 結(jié)果35-38
• 3.1 鎘對原代大鼠成骨細胞CaMKⅡ蛋白表達的影響35-36
• 3.2 鎘及2-APB對原代大鼠成骨細胞CaMKⅡ蛋白表達水平的影響36
• 3.3 鎘及KN93對原代大鼠成骨細胞細胞活性及UPR蛋白表達水平的影響36-38
• 4. 討論38-40
• 第三章 CaMKⅡ在鎘致成骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引發(fā)細胞調(diào)亡過程中的作用40-49
• 1. 材料40
• 1.1 實驗動物40
• 1.2 主要儀器40
• 1.3 主要試劑及材料40
• 2. 方法40-41
• 2.1 細胞核熒光染色40-41
• 2.2 Annexin V-FITC流式細胞檢測41
• 2.3 Western Blot分析凋亡蛋白表達41
• 2.4 數(shù)據(jù)分析41
• 3. 結(jié)果41-47
• 3.1 鎘及2-APB對原代大鼠成骨細胞Caspase蛋白表達的影響41-42
• 3.2 鎘及KN93對原代大鼠成骨細胞Caspase蛋白表達的影響42-43
• 3.3 鎘及2-APB或KN93對成骨細胞凋亡水平的影響43-47
• 3.3.1 鎘及2-APB或KN93對成骨細胞凋亡率的影響43-44
• 3.3.2 鎘及2-APB或KN93對成骨細胞核形態(tài)的影響44-45
• 3.3.3 鎘及2-APB或KN93對成骨細胞BCL2家族蛋白表達的影響45-47
• 4. 討論47-49
• 全文結(jié)論49-50
• 參考文獻50-63
• 致謝63-64
• 攻讀學位期間論文發(fā)表情況64-65

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號：731320