本文關(guān)鍵詞：豬生長(zhǎng)激素與促生長(zhǎng)肽的肝細(xì)胞內(nèi)化比較及亞細(xì)胞定位研究

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【摘要】：豬生長(zhǎng)激素(Porcine growth hormone,pGH)是由191個(gè)氨基酸組成的肽類(lèi)激素,對(duì)豬生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用。肝臟是pGH發(fā)揮作用的最重要靶器官之一,pGH的諸多生物學(xué)功能均通過(guò)肝細(xì)胞實(shí)現(xiàn)。傳統(tǒng)理論認(rèn)為pGH通過(guò)與細(xì)胞膜上生長(zhǎng)激素受體(Growth hormone receptor,GHR)結(jié)合后,引起pGH的一系列構(gòu)象變化,從而發(fā)揮其生理作用。但是近年關(guān)于人生長(zhǎng)激素(Human growth hormone,hGH)在鼠肝細(xì)胞中作用機(jī)理的研究表明,生長(zhǎng)激素(Growth hormone,GH)需要與GHR結(jié)合后才能內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞,進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)功能,其內(nèi)化后主要作用的部位可由亞細(xì)胞定位研究來(lái)明確。目前尚無(wú)GH在同種動(dòng)物細(xì)胞上的作用機(jī)制及亞細(xì)胞定位研究報(bào)道。本試驗(yàn)選用由新生仔豬肝臟所分離的肝細(xì)胞為研究對(duì)象,分別給予pGH及本研究室制備的具有模擬pGH作用的促生長(zhǎng)肽處理,進(jìn)行pGH與促生長(zhǎng)肽在不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞量的差異比較及pGH在亞細(xì)胞中的定位觀(guān)察,研究GH和促生長(zhǎng)肽在亞細(xì)胞水平上的作用的部位和結(jié)合方式上是否存在的差異。旨在研究pGH在豬肝細(xì)胞內(nèi)化現(xiàn)象以及內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞后的主要作用部位,為揭示GH在同種動(dòng)物細(xì)胞上的作用機(jī)制提供更加確切的試驗(yàn)依據(jù)。經(jīng)試驗(yàn)設(shè)計(jì),開(kāi)展了如下研究:首先,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和Western-blot試驗(yàn),對(duì)肝細(xì)胞的凋亡情況和細(xì)胞表面GHR的表達(dá)情況進(jìn)行鑒定,以驗(yàn)證試驗(yàn)所分離的肝細(xì)胞的活性。結(jié)果顯示:采用的豬原代細(xì)胞分離法所分離的豬肝細(xì)胞的細(xì)胞成活率達(dá)到80.94%;對(duì)原代分離的肝細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的觀(guān)測(cè)證明,細(xì)胞膜上GHR蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異,表明了新分離的細(xì)胞,能夠滿(mǎn)足試驗(yàn)可用性與一致性的要求。其次,采用共聚焦顯微鏡觀(guān)察p GH與促生長(zhǎng)肽內(nèi)化進(jìn)入豬肝細(xì)胞過(guò)程中的差異。對(duì)內(nèi)化過(guò)程不同時(shí)間點(diǎn)的觀(guān)察中發(fā)現(xiàn):細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與細(xì)胞核內(nèi)pGH均呈正態(tài)分布曲線(xiàn)趨勢(shì),即隨著內(nèi)化的開(kāi)始,pGH進(jìn)入細(xì)胞的量逐漸增多,達(dá)到峰值后開(kāi)始下降。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與細(xì)胞核內(nèi)pGH的內(nèi)化趨勢(shì)相似,但內(nèi)化速度上存在著明顯的差異,表現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)pGH在30 min左右時(shí)內(nèi)化程度達(dá)到最高,細(xì)胞核內(nèi)pGH在60 min左右時(shí)達(dá)到峰值,提示GH在細(xì)胞內(nèi)不同部位的結(jié)合及發(fā)揮作用存在著時(shí)間上的差異。促生長(zhǎng)肽也存在能夠與肝細(xì)胞結(jié)合并內(nèi)化現(xiàn)象,且內(nèi)化趨勢(shì)相似,但內(nèi)化速度有明顯加快,表現(xiàn)為內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核達(dá)到最大量的時(shí)間點(diǎn)均為15 min左右。第三,采用透射電鏡觀(guān)察pGH與促生長(zhǎng)肽內(nèi)化后肝細(xì)胞的形態(tài)。結(jié)果表明:與對(duì)照組相比,pGH與促生長(zhǎng)肽內(nèi)化達(dá)到最大量時(shí),細(xì)胞的形態(tài)及細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)各種細(xì)胞器、細(xì)胞核的形態(tài)均沒(méi)有明顯變化,表明pGH與促生長(zhǎng)肽的內(nèi)化,對(duì)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)上沒(méi)有明顯的影響,為進(jìn)一步的亞細(xì)胞定位研究奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。最后,采用膠體金免疫電鏡法對(duì)pGH與促生長(zhǎng)肽在肝細(xì)胞結(jié)合具體部位進(jìn)行亞細(xì)胞定位觀(guān)察研究。試驗(yàn)結(jié)果顯示pGH在刺激豬肝細(xì)胞20 min之后,已經(jīng)內(nèi)化進(jìn)入到細(xì)胞中,分別在線(xiàn)粒體、細(xì)胞核、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞膜部位發(fā)現(xiàn)存在結(jié)合現(xiàn)象;由結(jié)合膠體金的量多少判定結(jié)合部位的主次,依次為線(xiàn)粒體、細(xì)胞核、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞膜。由亞細(xì)胞定位觀(guān)察試驗(yàn),可判定線(xiàn)粒體和細(xì)胞核為pGH與肝細(xì)胞主要結(jié)合部位,并提示這也是pGH發(fā)揮作用的主要部位,該研究發(fā)現(xiàn)與鼠的同類(lèi)研究結(jié)果相似。綜上所述:pGH與促生長(zhǎng)肽在豬肝細(xì)胞上均能夠發(fā)生內(nèi)化現(xiàn)象,且內(nèi)化的整體趨勢(shì)相似;通過(guò)亞細(xì)胞定位觀(guān)察可知,pGH內(nèi)化后的主要作用部位依次是線(xiàn)粒體、細(xì)胞核、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞膜。
【關(guān)鍵詞】：豬生長(zhǎng)激素 促生長(zhǎng)肽 豬肝細(xì)胞 內(nèi)化 亞細(xì)胞定位
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S828
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 前言9-10
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述10-15
• 1.1 生長(zhǎng)激素(Growth hormone, GH)10-11
• 1.2 生長(zhǎng)激素受體11-13
• 1.3 生長(zhǎng)激素的內(nèi)化13-14
• 1.4 促生長(zhǎng)肽簡(jiǎn)介14
• 1.5 研究目的及意義14-15
• 第二篇 研究?jī)?nèi)容15-41
• 第一章 豬肝細(xì)胞活率及其表面生長(zhǎng)激素受體表達(dá)情況的鑒定試驗(yàn)15-23
• 1.1 材料與方法15-20
• 1.2 結(jié)果與分析20-22
• 1.3 討論22
• 1.4 小結(jié)22-23
• 第二章 豬生長(zhǎng)激素與促生長(zhǎng)肽在豬肝細(xì)胞上的內(nèi)化過(guò)程觀(guān)察試驗(yàn)23-31
• 2.1 材料與方法23-24
• 2.2 結(jié)果與分析24-29
• 2.3 討論29-30
• 2.4 小結(jié)30-31
• 第三章 豬生長(zhǎng)激素與促生長(zhǎng)肽與豬肝細(xì)胞結(jié)合的超微結(jié)構(gòu)觀(guān)察31-35
• 3.1 材料與方法31-32
• 3.2 結(jié)果與分析32-33
• 3.3 討論33-34
• 3.4 小結(jié)34-35
• 第四章 豬生長(zhǎng)激素在豬肝細(xì)胞上的亞細(xì)胞定位研究35-41
• 4.1 材料與方法35-36
• 4.2 結(jié)果與分析36-39
• 4.3 討論39-40
• 4.4 小結(jié)40-41
• 結(jié)論41-42
• 參考文獻(xiàn)42-50
• 作者簡(jiǎn)介50-51
• 致謝51

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：731325