本文關(guān)鍵詞：豬博卡病毒多重PCR檢測(cè)和分型研究

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【摘要】：豬博卡病毒(Porcine bocavirus,PBoV)是無(wú)囊膜單鏈線狀DNA博卡病毒屬成員。自2009年在瑞典患斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)豬體內(nèi)被檢測(cè)出后,在世界范圍內(nèi)廣泛流行,多個(gè)病毒種或基因型被發(fā)現(xiàn),依據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系可分為G1,G2,G3三個(gè)PBoV基因群組。這一新發(fā)豬病毒引起了各國(guó)的普遍關(guān)注,但人們對(duì)其研究仍處于初級(jí)的探索階段,PBoV的檢測(cè)和分型方法并不全面。因此發(fā)展有效和可靠的檢測(cè)技術(shù)對(duì)PBoV流行病學(xué)調(diào)查分析非常重要。在本研究中,分別構(gòu)建了PBoV普通多重PCR和EvaGreen多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法并應(yīng)用于臨床樣品檢測(cè)。本研究中,在對(duì)三個(gè)基因群組基因組序列進(jìn)行同源性分析的基礎(chǔ)上,分別設(shè)計(jì)特異性引物,首先構(gòu)建了一個(gè)普通多重PCR方法用于同時(shí)檢測(cè)和鑒定不同分型的PBoV。此方法可特異地檢測(cè)三個(gè)PBoV基因群組,對(duì)PBoV G1,PBoV G2和PBoV G3檢測(cè)靈敏度分別為1.0×103,4.5×103和3.8×103 copies/μL,與三個(gè)PBoV基因群組普通單重PCR的靈敏度1.0×103 copies/μL相近。利用新建立的多重PCR檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)227個(gè)臨床樣品。PBoV G1,PBoV G2和PBoV G3檢測(cè)陽(yáng)性率分別為1.3%,2.6%和12.3%。其中三個(gè)基因群組檢測(cè)有混合感染,PBoV G1與PBoV G3、PBoV G2與PBoV G3及PBoV G1、PBoV G2與PBoV G3混合感染檢出率分別為0.4%、0.9%和0.4%。除在豬糞樣品中多檢測(cè)出一個(gè)PBoV G2陽(yáng)性外,PBoV基因群組單重PCR結(jié)果與多重PCR結(jié)果相同。建立的基于EvaGreen PBoV單重或多重實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增后經(jīng)熔解曲線分析,三個(gè)基因群組的擴(kuò)增產(chǎn)物均形成特異熔解峰,PBoV G1、PBoV G2和PBoV G3的Tm值分別為81.3±0.34°C,78.2±0.37°C和85.0±0.29°C,各病毒間Tm值間隔在3°C左右,而非靶標(biāo)病毒及空白陰性對(duì)照無(wú)特異熔解峰產(chǎn)生,通過(guò)Tm差異可區(qū)分鑒定三個(gè)PBoV基因群組,表明建立的方法具有良好的特異性。三個(gè)基因群組EvaGreen單重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)靈敏度分別為25 copies/μL(PBoV G1),10 copies/μL(PBoV G2)和25 copies/μL(PBoV G3);而EvaGreen多重實(shí)時(shí)熒光PCR體系下單個(gè)基因群組的檢測(cè)靈敏度稍有下降,依次為100 copies/μL(PBoV G1)、50 copies/μL(PBoV G2)和100 copies/μL(PBoV G3);三個(gè)基因群組同時(shí)存在時(shí)EvaGreen多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)靈敏度依次為250 copies/μL(PBoV G1),250 copies/μL(PBoV G2)和100 copies/μL(PBoV G3)。EvaGreen單重實(shí)時(shí)熒光PCR和EvaGreen多重實(shí)時(shí)熒光PCR的重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)都小于5%,具有較好的重復(fù)性。EvaGreen多重實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)227個(gè)樣品檢測(cè)結(jié)果為:PBoV G1陽(yáng)性率為15.0%,PBoV G2的陽(yáng)性率為25.1%,PBoV G3的陽(yáng)性率為41.9%,與利用EvaGreen單重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的17.2%PBoV G1,29.1%PBoV G2和44.5%PBoV G3陽(yáng)性率結(jié)果較為一致;其中,PBoV G1與PBoV G2、PBoV G1與PBoV、G3 PBoV G2與PBoV G3及PBoV G1、PBoV G2與PBoV G3混合感染檢出率分別為3.1%、5.7%、13.2%及3.1%。上述結(jié)果表明PBoV在國(guó)內(nèi)豬群中較流行。對(duì)PBoV檢測(cè)陽(yáng)性的樣品進(jìn)行克隆測(cè)序,并將測(cè)得的目的片段序列分別與PBoV全基因組序列或者接近全基因組序列間的核苷酸序列進(jìn)行基因序列比對(duì)、同源性和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。結(jié)果顯示三組PBoV基因群組內(nèi)的同源性比較高,范圍在72.1-100%之間,而基因群組間的核苷酸序列同源性較低為3.2-54.2%,表明將本研究構(gòu)建的普通多重PCR和EvaGreen多重實(shí)時(shí)熒光PCR兩組PBoV檢測(cè)方法選擇的診斷區(qū)區(qū)分PBoV G1、PBoV G2與PBoV G3三個(gè)基因群組的基因分型方法可行且具有代表性,同時(shí)證實(shí)豬群中PBoV具有較高的遺傳多樣性。本研究成功構(gòu)建立了普通多重PCR和Eva Green多重實(shí)時(shí)熒光PCR兩組PBoV檢測(cè)和分型方法,可以滿足不同調(diào)查和研究的檢測(cè)需求,這兩組多重PCR檢測(cè)方法能最大限度地節(jié)約檢測(cè)時(shí)間,提高工作效率,適合養(yǎng)豬場(chǎng)大批量檢測(cè)需求,為PBoV的流行病學(xué)調(diào)查研究和臨床檢測(cè)提供了良好的檢測(cè)技術(shù)手段。
【關(guān)鍵詞】：豬博卡病毒 基因群組 多重PCR EvaGreen多重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-13
• 第一章 緒論13-21
• 1.1 PBoV的發(fā)現(xiàn)13
• 1.2 PBoV的分類(lèi)13-15
• 1.3 PBoV的分子生物學(xué)特性15-16
• 1.4 PBoV的流行病學(xué)調(diào)查和疾病相關(guān)性16-18
• 1.4.1 國(guó)內(nèi)PBoV的流行情況16-17
• 1.4.2 國(guó)外PBoV的流行情況17-18
• 1.5 PBoV的檢測(cè)技術(shù)18-21
• 1.5.1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)18
• 1.5.2 間接免疫熒光法18-19
• 1.5.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)19
• 1.5.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)19-21
• 第二章 PBoV多重PCR檢測(cè)和基因分型研究的實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)21-24
• 2.1 本研究的目的、意義21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)主要內(nèi)容21-23
• 2.2.1 引物設(shè)計(jì)21-22
• 2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建及普通多重PCR構(gòu)建22
• 2.2.3 三個(gè)PBoV基因群組單重實(shí)時(shí)熒光PCR體系的優(yōu)化和建立22
• 2.2.4 多重實(shí)時(shí)熒光PCR體系同時(shí)檢測(cè)三個(gè)PBoV基因群組的優(yōu)化和建立22-23
• 2.3 實(shí)驗(yàn)流程23-24
• 第三章 PBoV多重PCR檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用24-36
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料24-25
• 3.1.1 病毒和臨床樣品24-25
• 3.1.2 主要試劑25
• 3.1.3 主要儀器設(shè)備25
• 3.2 引物設(shè)計(jì)25-26
• 3.3 病毒核酸提取和質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備26-27
• 3.3.1 PBoV DNA提取26
• 3.3.2 PCR反應(yīng)26
• 3.3.3 PCR產(chǎn)物割膠回收26
• 3.3.4 PCR目的片段連接26
• 3.3.5 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化26
• 3.3.6 重組質(zhì)粒提取26-27
• 3.3.7 重組質(zhì)粒鑒定27
• 3.3.8 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備27
• 3.4 PBoV多重PCR體系建立27-28
• 3.4.1 PBoV多重PCR體系優(yōu)化27
• 3.4.2 PBoV多重PCR靈敏度和特異性27-28
• 3.5 PBoV臨床樣品多重PCR檢測(cè)28
• 3.5.1 樣品核酸提取28
• 3.5.2 臨床樣品檢測(cè)28
• 3.6 結(jié)果28-33
• 3.6.1 PBoV序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析圖28-30
• 3.6.2 標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建30
• 3.6.3 PBoV多重PCR體系優(yōu)化30-31
• 3.6.4 PBoV G1, PboV G2和G3 Pbo V多重PCR特異性和靈敏度31-33
• 3.6.5 臨床樣品單重和多重普通PCR檢測(cè)33
• 3.7 討論33-36
• 第四章 EvaGreen多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)PBoV三個(gè)基因群組方法的建立和應(yīng)用36-56
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料36-37
• 4.1.1 毒源36-37
• 4.1.2 主要試劑37
• 4.1.3 主要儀器設(shè)備37
• 4.2 引物設(shè)計(jì)37-38
• 4.3 PBoV EvaGreen單重實(shí)時(shí)熒光PCR38-39
• 4.3.1 PBoV單重?zé)晒釶CR特異性及產(chǎn)物Tm值38
• 4.3.2 PBoV單重?zé)晒釶CR靈敏度及重復(fù)性38-39
• 4.4 PBoVEvaGreen多重實(shí)時(shí)熒光PCR39-40
• 4.4.1 PBoV多重?zé)晒釶CR特異性及產(chǎn)物Tm值39
• 4.4.2 PBoV多重?zé)晒釶CR靈敏度及重復(fù)性39-40
• 4.5 PBoVEvaGreen多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)臨床樣品40
• 4.5.1 臨床樣品及樣品核酸提取40
• 4.5.2 臨床樣品檢測(cè)40
• 4.6 結(jié)果40-52
• 4.6.1 PBoV單重實(shí)時(shí)熒光PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物Tm值40-41
• 4.6.2 PBoV單重實(shí)時(shí)熒光PCR特異性41-42
• 4.6.3 PBoV單重實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度及標(biāo)準(zhǔn)曲線42-43
• 4.6.4 PBoV單重實(shí)時(shí)熒光PCR重復(fù)性43-45
• 4.6.5 PBoV多重實(shí)時(shí)熒光PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物Tm值45
• 4.6.6 PBoV多重實(shí)時(shí)熒光PCR特異性45-46
• 4.6.7 單個(gè)PBoV模板多重實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度及標(biāo)準(zhǔn)曲線46-48
• 4.6.8 多個(gè)PBoV模板多重實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度48-49
• 4.6.9 PBoV多重實(shí)時(shí)熒光PCR重復(fù)性49-50
• 4.6.10 PBoV臨床樣品實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)50-52
• 4.7 討論52-56
• 第五章 PBoV遺傳多樣性分析56-63
• 5.1 材料和方法56
• 5.2 結(jié)果56-61
• 5.3 討論61-63
• 結(jié)論與展望63-64
• 參考文獻(xiàn)64-68
• 研究生學(xué)習(xí)期間主要成果68-69
• 致謝69

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本文編號(hào)：726299