本文關(guān)鍵詞：熱應(yīng)激需求蛋白HtrA在副豬嗜血桿菌應(yīng)激及粘附中的作用研究

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【摘要】：副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)為格拉瑟氏病(Gl?sser’s disease)的病原,為定殖于健康豬上呼吸道的條件致病菌,在某些條件下能夠侵入機(jī)體并引發(fā)豬的多發(fā)性、系統(tǒng)性疾病。熱應(yīng)激需求蛋白(high temperature requirement A)Htr A家族是一類在單細(xì)胞和多細(xì)胞生物中高度保守的蛋白酶,在蛋白質(zhì)質(zhì)量控制過(guò)程中極為重要。在許多病原菌當(dāng)中,htr A編碼的熱應(yīng)激需求蛋白與其自身生存及毒力密切相關(guān)。本課題主要研究了副豬嗜血桿菌中Htr A對(duì)于其在應(yīng)激條件下的自身存活及對(duì)宿主細(xì)胞粘附能力的影響,取得的主要結(jié)果如下:1.Nagasaki-Δhtr A缺失株的構(gòu)建及鑒定構(gòu)建重組質(zhì)粒p K18mobsac B-htr A-UKD自然轉(zhuǎn)化至副豬嗜血桿菌血清5型參考菌株Nagasaki中,并以kan抗性篩選得到htr A缺失突變株Nagasaki-Δhtr A。通過(guò)PCR、RT-PCR、Southern blot等鑒定方法,證明htr A基因缺失株構(gòu)建成功。2.Nagasaki野生株與Nagasaki-Δhtr A缺失株環(huán)境適應(yīng)性比較將Nagasaki與Nagasaki-Δhtr A分別在37℃及40℃培養(yǎng)并繪制生長(zhǎng)曲線,結(jié)果表明在37℃及40℃條件下缺失菌株的生長(zhǎng)曲線受到不同程度的影響,且40℃時(shí)缺失菌株的生長(zhǎng)顯著減緩,活菌數(shù)降低。在p H6.5及p H8.5的條件下培養(yǎng)并繪制生長(zhǎng)曲線,結(jié)果表明偏酸性條件下兩株菌的生長(zhǎng)曲線均受到顯著影響,而在偏堿性條件下兩株菌的生長(zhǎng)曲線受影響程度較小,對(duì)數(shù)期時(shí)同一時(shí)間點(diǎn)時(shí)缺失株的OD600值低于野生株,證明缺失株環(huán)境適應(yīng)性較野生株弱。掃描電鏡觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺失株的菌體表面較野生株光滑。3.副豬嗜血桿菌中Htr A與菌株的抗吞噬及粘附能力、血清抗性相關(guān)與豬肺泡巨噬細(xì)胞(3D4/2)互作后顯示Nagasaki-Δhtr A抗吞噬能力顯著高于野生菌株。與豬腎上皮細(xì)胞(PK-15)及豬髖動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(PIEC)互作后顯示Nagasaki-Δhtr A的粘附指數(shù)在0.5h、1.5h、2.5h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)顯著低于Nagasaki野生株。加入原核表達(dá)的Htr A后Nagasaki野生株對(duì)豬腎上細(xì)胞(PK-15)的粘附能力顯著增強(qiáng)。血清抗性試驗(yàn)結(jié)果表明,在缺失htr A基因之后Nagasaki的血清抗性顯著提高。4.熒光定量實(shí)驗(yàn)篩選存活、粘附相關(guān)差異表達(dá)基因選出副豬嗜血桿菌與細(xì)菌粘附侵入、熱休克、血清抗性有關(guān)的基因進(jìn)行相對(duì)熒光定量實(shí)驗(yàn),在37℃條件下,htr A基因的缺失會(huì)顯著下調(diào)rfa E、thy A、cdt B、nan H、rfa F基因的表達(dá),這些基因與副豬嗜血桿菌的粘附定殖能力相關(guān),和之前粘附能力顯著下降的表型一致。而較顯著上調(diào)表達(dá)的有ops X基因和clp P基因,分別與血清抗性及熱休克相關(guān);40℃時(shí)htr A基因的缺失所下調(diào)表達(dá)的基因也主要是與粘附相關(guān),另外兩個(gè)熱休克相關(guān)基因deg S、clp P也下調(diào)表達(dá)。證明htr A的缺失影響到了重要相關(guān)功能基因的表達(dá)。綜上,本研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激需求蛋白Htr A與副豬嗜血桿菌應(yīng)激耐受、粘附能力、抗吞噬、血清抗性等相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：副豬嗜血桿菌 熱應(yīng)激需求蛋白HtrA 應(yīng)激應(yīng)答 粘附
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 縮略詞表（Abbreviation）11-12
• 1. 文獻(xiàn)綜述12-21
• 1.1 副豬嗜血桿菌概述12-15
• 1.1.1 副豬嗜血桿菌流行病學(xué)及致病機(jī)理12-13
• 1.1.2 副豬嗜血桿菌的重要功能基因13-15
• 1.2 HtrA研究進(jìn)展15-21
• 1.2.1 HtrA的結(jié)構(gòu)及作用方式15-17
• 1.2.2 HtrA的功能17-19
• 1.2.3 病原菌中的HtrA19-21
• 2. 研究目的與意義21-22
• 3. 材料與方法22-42
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料22-28
• 3.1.1 菌株、質(zhì)粒、細(xì)胞22
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)所用酶、試劑及試劑盒22-23
• 3.1.3 培養(yǎng)基及抗生素的配制23
• 3.1.4 主要溶液的配制23-25
• 3.1.5 主要儀器25-26
• 3.1.6 引物26-28
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法28-42
• 3.2.1 重組自殺性質(zhì)粒的構(gòu)建28-31
• 3.2.2 自然轉(zhuǎn)化篩選基因缺失突變株Nagasaki-ΔHtrA::kan31-32
• 3.2.3 ΔhtrA基因缺失株的鑒定32-35
• 3.2.4 菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定35-36
• 3.2.5 掃描電鏡觀察細(xì)菌菌體36
• 3.2.6 3D4/2 細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)36-37
• 3.2.7 細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)37
• 3.2.8 血清抗性實(shí)驗(yàn)37-38
• 3.2.9 His-HtrA蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化38-40
• 3.2.10 HtrA蛋白功能研究40-41
• 3.2.11 熒光定量實(shí)驗(yàn)41-42
• 4. 結(jié)果與分析42-55
• 4.1 重組自殺質(zhì)粒的構(gòu)建42-43
• 4.2 ΔHtrA基因缺失株的鑒定43-45
• 4.2.1 PCR鑒定43
• 4.2.2 RT-PCR驗(yàn)證基因缺失和極性效應(yīng)檢測(cè)43-44
• 4.2.3 Southern blot鑒定44-45
• 4.3 菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定45-47
• 4.3.1 不同溫度條件下的生長(zhǎng)曲線的測(cè)定45-47
• 4.3.2 不同p H條件下的生長(zhǎng)曲線的測(cè)定47
• 4.4 掃描電鏡觀察細(xì)菌菌體47-48
• 4.5 3D4/2 細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)48
• 4.6 細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)48-50
• 4.6.1 PK-15 細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)48-49
• 4.6.2 PIEC細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)49-50
• 4.7 血清抗性實(shí)驗(yàn)50
• 4.8 His-HtrA蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化50-51
• 4.9 HtrA蛋白功能研究51-53
• 4.9.1 HtrA蛋白對(duì)上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）的切割實(shí)驗(yàn)51-52
• 4.9.2 HtrA的免疫原性及反應(yīng)原性檢測(cè)52
• 4.9.3 HtrA促進(jìn)菌株對(duì)PK-15 細(xì)胞的粘附52-53
• 4.10 熒光定量實(shí)驗(yàn)53-55
• 5. 討論55-59
• 5.1 自然轉(zhuǎn)化法構(gòu)建HtrA缺失突變株55
• 5.2 HtrA的缺失影響副豬嗜血桿菌應(yīng)激狀態(tài)下的存活能力55-56
• 5.3 HtrA的缺失影響副豬嗜血桿菌抗 3D4/2 吞噬能力及血清抗性56
• 5.4 HtrA的缺失影響副豬嗜血桿菌對(duì)細(xì)胞的粘附能力56-57
• 5.5 副豬嗜血桿菌HtrA蛋白功能的研究57-58
• 5.6 副豬嗜血桿菌HtrA的缺失所影響的重要功能基因58-59
• 6. 結(jié)論59-60
• 參考文獻(xiàn)60-67
• 附錄67-69
• 致謝69

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