本文關(guān)鍵詞：禽源鮑曼不動(dòng)桿菌的分離鑒定與OmpA蛋白的原核表達(dá)及其初步應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： 鮑曼不動(dòng)桿菌 流行病學(xué) 系統(tǒng)發(fā)育分析 OmpA蛋白 間接ELISA

【摘要】：鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumanii,Ab)是醫(yī)院內(nèi)分離率位居第二的常見于人類感染的非發(fā)酵菌。其常會(huì)造成嚴(yán)重的醫(yī)院內(nèi)感染,包括皮膚和軟組織的感染、傷口感染、泌尿系統(tǒng)感染、繼發(fā)性腦膜炎、呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎和菌血癥等并導(dǎo)致人類死亡。然而對(duì)于動(dòng)物源鮑曼不動(dòng)桿菌引起的動(dòng)物感染或者帶菌情況的報(bào)道遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有人類多,尤其禽類感染鮑曼不動(dòng)桿菌的情況鮮有報(bào)道,故探明其在禽類的感染率或者有否人源菌株感染禽類等流行病學(xué)情況具有重要的現(xiàn)實(shí)和公共衛(wèi)生意義。本課題首次開展了不動(dòng)桿菌在家禽中感染情況的調(diào)查研究,并對(duì)流行菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。此外,通過對(duì)外膜蛋白A(OmpA)進(jìn)行原核表達(dá),分析其免疫原性,并基于此建立了間接ELISA方法,以及進(jìn)行了初步應(yīng)用。本研究對(duì)2014年9月至2015年10月的發(fā)病蛋雞的肝臟、脾臟、肺、氣管和十二指腸等450份病料進(jìn)行鮑曼不動(dòng)桿菌的分離鑒定。對(duì)分離菌進(jìn)行了形態(tài)特征、培養(yǎng)特性的觀察、生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)、小鼠致病性試驗(yàn)和特異性基因檢測(cè),結(jié)果共分離到2株鮑曼不動(dòng)桿菌,流行率僅0.44%(95%CI,0.1-1.6)。2株鮑曼不動(dòng)桿菌均對(duì)多種抗生素耐藥,且對(duì)小鼠有較強(qiáng)的致病性,LD50均達(dá)到7.09×107CFU/0.5 m L。這為研究鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)禽類的致病性以及其感染的流行情況等提供了材料基礎(chǔ)。為了更好的認(rèn)識(shí)禽源鮑曼不動(dòng)桿菌的遺傳進(jìn)化地位及其溯源,本研究基于管家基因rec A、gyr B、rpo B結(jié)合16S r RNA基因?qū)?株禽源分離株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明,進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)2株禽源分離株與人源鮑曼不動(dòng)桿菌遺傳距離最近,與大腸桿菌遺傳距離最遠(yuǎn),核苷酸同源性分析顯示禽源分離菌核苷酸同源性均與人源鮑曼不動(dòng)桿菌的最高,高達(dá)92%-99.9%。以上結(jié)果說明禽源分離菌可能由人源菌株進(jìn)化而來,這顯示了重要的公共衛(wèi)生意義。證明了rec A、gyr B、rpo B基因聯(lián)合16S r RNA基因可用于不動(dòng)桿菌屬菌種鑒定,探索了一種鑒定該菌的新方法。通過設(shè)計(jì)特異性引物,擴(kuò)增OmpA基因,克隆至原核表達(dá)載體p ET28a(+),構(gòu)建重組質(zhì)粒p ET28a-OmpA,轉(zhuǎn)化至BL21菌體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。通過條件摸索,確定最佳誘導(dǎo)條件,之后采用瓊脂糖Ni柱純化重組蛋白,并對(duì)其進(jìn)行Western blot分析。SDS-PAGE結(jié)果表明,在37℃經(jīng)0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5 h的條件下,重組菌株能表達(dá)出約41 k Da的融合蛋白,與預(yù)期大小一致。Western blot分析顯示,該融合蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。以上結(jié)果為進(jìn)一步建立快速簡(jiǎn)便的免疫學(xué)檢測(cè)方法和進(jìn)行血清流行病學(xué)調(diào)查奠定基礎(chǔ)。以純化的OmpA蛋白作為抗原進(jìn)行包板,建立了針對(duì)抗雞鮑曼不動(dòng)桿菌抗體的間接ELISA檢測(cè)方法。本文所建立的ELISA方法具有良好的重復(fù)性和特異性,對(duì)來自河南不同地市的399份雞血清進(jìn)行鮑曼不動(dòng)桿菌抗體的檢測(cè),結(jié)果顯示陽性率有3.75%。本研究所建立的ELISA方法可用于臨床樣品的血清學(xué)檢測(cè),并為雞群中鮑曼不動(dòng)桿菌的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了有效的檢測(cè)方法。
【關(guān)鍵詞】：鮑曼不動(dòng)桿菌 流行病學(xué) 系統(tǒng)發(fā)育分析 OmpA蛋白 間接ELISA
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 致謝4-9
• 英文縮寫詞表9-10
• 摘要10-11
• 文獻(xiàn)綜述11-22
• 1.1 不動(dòng)桿菌的發(fā)現(xiàn)11
• 1.2 生長(zhǎng)與培養(yǎng)特性11-12
• 1.3 流行病學(xué)調(diào)查12-15
• 1.4 鮑曼不動(dòng)桿菌的毒力因素15-18
• 1.5 鮑曼不動(dòng)桿菌診斷方法研究進(jìn)展18-21
• 1.6 小結(jié)21-22
• 試驗(yàn)研究22-58
• 試驗(yàn)一 禽源鮑曼不動(dòng)桿菌的分離鑒定22-29
• 1.1 材料22-23
• 1.1.1 病料來源及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物22
• 1.1.2 培養(yǎng)基和主要試劑22-23
• 1.2 方法23-24
• 1.2.1 病原菌的分離培養(yǎng)與純化23
• 1.2.2 細(xì)菌生化鑒定23
• 1.2.3 特異性基因檢測(cè)23
• 1.2.4 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)23
• 1.2.5 小鼠致病性試驗(yàn)23-24
• 1.3 結(jié)果24-26
• 1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)特性和鏡檢結(jié)果24-25
• 1.3.2 生化試驗(yàn)結(jié)果25
• 1.3.3 特異性基因檢測(cè)25
• 1.3.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果25-26
• 1.3.5 小鼠致病性試驗(yàn)26
• 1.4 討論26-29
• 試驗(yàn)二 禽源鮑曼不動(dòng)桿菌的系統(tǒng)發(fā)育分析29-42
• 2.1 材料29-30
• 2.1.1 菌株29
• 2.1.2 主要儀器29
• 2.1.3 主要試劑29-30
• 2.2 方法30-31
• 2.2.1 引物設(shè)計(jì)30
• 2.2.2 細(xì)菌DNA的提取30
• 2.2.3 管家基因的PCR擴(kuò)增30-31
• 2.2.4 管家基因的序列測(cè)定和分析31
• 2.2.5 基于管家基因的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建和同源性分析31
• 2.3 結(jié)果31-38
• 2.3.1 管家基因的PCR擴(kuò)增31-32
• 2.3.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定和測(cè)序結(jié)果32
• 2.3.3 基于4個(gè)管家基因的系統(tǒng)發(fā)育分析32-35
• 2.3.4 基于4個(gè)管家基因的同源性分析35-38
• 2.4 討論38-42
• 試驗(yàn)三 禽源鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA基因的原核表達(dá)和免疫原性分析42-52
• 3.1 材料42-43
• 3.1.1 菌株，質(zhì)粒和試驗(yàn)動(dòng)物42
• 3.1.2 主要儀器42-43
• 3.1.3 主要試劑43
• 3.2 方法43-45
• 3.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成43
• 3.2.2 細(xì)菌DNA的提取43
• 3.2.3 OmpA基因的擴(kuò)增及序列分析43-44
• 3.2.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建44
• 3.2.5 重組蛋白的表達(dá)44
• 3.2.6 重組蛋白的純化44-45
• 3.2.7 多克隆抗體的制備45
• 3.2.8 Western blot分析45
• 3.3 結(jié)果45-51
• 3.3.1 目的基因的擴(kuò)增45-46
• 3.3.2 目的基因序列分析46-47
• 3.3.3 重組質(zhì)粒pET28a-OmpA的雙酶切鑒定47-48
• 3.3.4 重組蛋白的表達(dá)與純化48-50
• 3.3.5 Western blot分析50-51
• 3.4 討論51-52
• 試驗(yàn)四 基于禽源鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA蛋白的間接ELISA方法的建立及應(yīng)用52-58
• 4.1.材料52-53
• 4.1.1 抗原與血清52
• 4.1.2 主要試劑和耗材52
• 4.1.3 主要儀器設(shè)備52
• 4.1.4 ELISA所需的試劑52-53
• 4.2 方法53-54
• 4.2.1 陽性血清的制備53
• 4.2.2 抗原的純化53
• 4.2.3 最佳抗原包被濃度和血清最佳稀釋度的確定53-54
• 4.2.4 最佳包板時(shí)間和溫度的確定54
• 4.2.5 最佳二抗稀釋比例的確定54
• 4.2.6 間接ELISA臨界值判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定54
• 4.2.7 間接ELISA的特異性分析54
• 4.2.8 間接ELISA的重復(fù)性試驗(yàn)54
• 4.2.9 間接ELISA的初步應(yīng)用54
• 4.3 結(jié)果54-56
• 4.3.1 OmpA重組蛋白的純化54-55
• 4.3.2 最佳抗原包被濃度和血清最佳稀釋度55
• 4.3.3 最佳抗原包被時(shí)間和溫度55
• 3.3.4 最佳二抗稀釋比例55
• 4.3.5 臨界值判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定55
• 4.3.6 特異性分析55-56
• 4.3.7 重復(fù)性試驗(yàn)56
• 4.3.8 初步應(yīng)用56
• 4.4 討論56-58
• 全文總結(jié)58-59
• 參考文獻(xiàn)59-72
• 附：作者讀研期間發(fā)表文章72-73
• ABSTRACT73-74

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 雷金娥;袁莉;李和平;曾曉艷;;耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌金屬β-內(nèi)酰胺酶的研究[J];現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志;2009年27期

2 孫立群;王冬梅;夏燕杰;;2010至2011年鮑曼不動(dòng)桿菌感染分布特征及耐藥性分析[J];微生物學(xué)雜志;2013年02期

3 黃雪斐,管利民,余素飛;鮑曼不動(dòng)桿菌感染127例分析[J];海南醫(yī)學(xué);1999年03期

4 黃日安;戴湘春;林湛;柯水源;;粵西地區(qū)醫(yī)院278株鮑曼不動(dòng)桿菌感染調(diào)查及耐藥情況分析[J];中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥;2007年20期

5 呂娟;朱衛(wèi)民;;主動(dòng)外排機(jī)制介導(dǎo)鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)藥(抗生素分冊(cè));2010年03期

6 胡巧娟;胡志東;;多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的研究進(jìn)展[J];國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2010年10期

7 楊長(zhǎng)亮;黃前川;;鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成的調(diào)節(jié)[J];中國(guó)感染控制雜志;2012年03期

8 劉坤鋒;吳潔;顧覺奮;;抗鮑曼不動(dòng)桿菌藥物研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)藥(抗生素分冊(cè));2013年05期

9 周月清,黃支密,陸開來;杭州和湖州鮑曼不動(dòng)桿菌β內(nèi)酰胺酶和氨基糖苷類修飾酶基因研究[J];中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志;2005年03期

10 劉滔滔;鐘小斌;陳龍英;廖鶯;;多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的基因分型及感染治療分析[J];廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2006年03期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 楊培洪;凌保東;;多重PCR技術(shù)在檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因中的應(yīng)用[A];第十屆全國(guó)化療藥理暨抗感染藥理高峰論壇資料匯編[C];2010年

2 王芳;易濱;涂顯春;雷紅;孫敏霞;劉軍;趙曉曉;;鮑曼不動(dòng)桿菌快速檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用[A];中國(guó)醫(yī)院協(xié)會(huì)第十八屆全國(guó)醫(yī)院感染管理學(xué)術(shù)年會(huì)論文資料匯編[C];2011年

3 薛寶升;;鮑曼不動(dòng)桿菌感染[A];第六屆全國(guó)燒傷救治專題研討會(huì)論文匯編[C];2009年

4 劉嘉琳;于沁;瞿洪平;;多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌防控及抗生素優(yōu)化方案的前瞻性研究[A];第三屆重癥醫(yī)學(xué)大會(huì)論文匯編[C];2009年

5 董寶坤;;多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染干預(yù)措施評(píng)價(jià)[A];全國(guó)醫(yī)院感染護(hù)理新進(jìn)展研討會(huì)論文匯編[C];2010年

6 孫立新;劉蘭平;耿蓉娜;溫嬋;;兒童住院患者感染鮑曼不動(dòng)桿菌的監(jiān)測(cè)分析[A];中國(guó)醫(yī)院協(xié)會(huì)第十八屆全國(guó)醫(yī)院感染管理學(xué)術(shù)年會(huì)論文資料匯編[C];2011年

7 郇京寧;;耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染的治療[A];急慢性創(chuàng)面治療新技術(shù)專題系列研討會(huì)之感染創(chuàng)面綜合治療論壇論文匯編[C];2011年

8 董濤;童衛(wèi)杭;李聰然;錢皎;王睿;;氟喹諾酮類和氨基糖苷類抗生素對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌體外抗菌活性的研究[A];創(chuàng)新藥物及新品種研究、開發(fā)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2006年

9 董濤;童衛(wèi)杭;李聰然;錢皎;王睿;;氟喹諾酮類和氨基糖苷類抗生素對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌體外抗菌活性的研究[A];2006第六屆中國(guó)藥學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2006年

10 董濤;王睿;童衛(wèi)杭;柴棟;裴斐;梁蓓蓓;方翼;范燕;李聰然;;鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥株主動(dòng)外排機(jī)制研究[A];2006第六屆中國(guó)藥學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2006年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 陶慶春;警惕鮑曼不動(dòng)桿菌[N];健康報(bào);2006年

2 通訊員朱水英 記者李水根;鮑曼不動(dòng)桿菌研究獲多項(xiàng)創(chuàng)新成果[N];健康報(bào);2010年

3 祝建芳邋朱水英 特約記者 俞欣;鮑曼不動(dòng)桿菌存在新耐藥基因[N];健康報(bào);2008年

4 福建省立醫(yī)院呼吸內(nèi)科主治醫(yī)師 王大旋 本報(bào)記者 曾令浩 整理;治療多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染,聯(lián)合用藥為王道[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2011年

5 山東省日照市人民醫(yī)院 劉麗娟 北京大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 陳宏斌;院內(nèi)細(xì)菌耐藥有分布圖[N];健康報(bào);2014年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 李曦;鮑曼不動(dòng)桿菌plsC與abrP介導(dǎo)替加環(huán)素耐藥機(jī)制的研究[D];浙江大學(xué);2016年

2 陳菁;多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的分子流行特征分析及整合子介導(dǎo)的耐藥機(jī)制研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2014年

3 應(yīng)春妹;碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制研究[D];上海交通大學(xué);2015年

4 李沖;山東省ICU鮑曼不動(dòng)桿菌血流感染的臨床研究[D];山東大學(xué);2016年

5 彭敬紅;鮑曼不動(dòng)桿菌醫(yī)院感染及耐藥機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2009年

6 陳威震;多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的分子流行病學(xué)和耐藥相關(guān)機(jī)制的研究[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2011年

7 許攀峰;多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌基因組與“耐藥島”的比較基因組學(xué)研究[D];浙江大學(xué);2012年

8 符一騏;中國(guó)部分地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌多位點(diǎn)序列分型及碳青霉烯類抗生素耐藥機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2012年

9 劉丁;鮑曼不動(dòng)桿菌醫(yī)院感染流行病學(xué)調(diào)查及耐藥機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2002年

10 汪楊;自噬在真核細(xì)胞對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的清除中的作用的研究[D];吉林大學(xué);2015年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王禹;多重耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體的篩選及其理化性質(zhì)與生物信息學(xué)分析[D];大連大學(xué);2015年

2 梁立杰;機(jī)械通氣住院患者多重耐藥（MDR）鮑曼不動(dòng)桿菌感染分布特征及耐藥影響因素[D];河北聯(lián)合大學(xué);2014年

3 張旭;替加環(huán)素治療泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌所致呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎的臨床療效分析[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

4 閆振宇;泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌呼吸機(jī)相關(guān)肺炎巢式病例對(duì)照研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

5 鄭薇;多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素耐藥相關(guān)機(jī)制的研究[D];成都醫(yī)學(xué)院;2015年

6 裴歡歡;2010-2012年某三甲醫(yī)院多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染的臨床特征、危險(xiǎn)因素及預(yù)后分析[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

7 楊艷;廈門地區(qū)泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制的研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

8 晏奎;磷霉素對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜干預(yù)作用的體外研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2015年

9 魏振波;鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白A1S_0115A的克隆、表達(dá)及免疫保護(hù)性研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

10 盧靈鋒;多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥基因及分子流行病學(xué)研究[D];四川醫(yī)科大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：710404