本文關鍵詞：禽源鮑曼不動桿菌的分離鑒定與OmpA蛋白的原核表達及其初步應用

  更多相關文章： 鮑曼不動桿菌 流行病學 系統(tǒng)發(fā)育分析 OmpA蛋白 間接ELISA

【摘要】：鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumanii,Ab)是醫(yī)院內分離率位居第二的常見于人類感染的非發(fā)酵菌。其常會造成嚴重的醫(yī)院內感染,包括皮膚和軟組織的感染、傷口感染、泌尿系統(tǒng)感染、繼發(fā)性腦膜炎、呼吸機相關性肺炎和菌血癥等并導致人類死亡。然而對于動物源鮑曼不動桿菌引起的動物感染或者帶菌情況的報道遠遠沒有人類多,尤其禽類感染鮑曼不動桿菌的情況鮮有報道,故探明其在禽類的感染率或者有否人源菌株感染禽類等流行病學情況具有重要的現(xiàn)實和公共衛(wèi)生意義。本課題首次開展了不動桿菌在家禽中感染情況的調查研究,并對流行菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析。此外,通過對外膜蛋白A(OmpA)進行原核表達,分析其免疫原性,并基于此建立了間接ELISA方法,以及進行了初步應用。本研究對2014年9月至2015年10月的發(fā)病蛋雞的肝臟、脾臟、肺、氣管和十二指腸等450份病料進行鮑曼不動桿菌的分離鑒定。對分離菌進行了形態(tài)特征、培養(yǎng)特性的觀察、生化試驗、藥敏試驗、小鼠致病性試驗和特異性基因檢測,結果共分離到2株鮑曼不動桿菌,流行率僅0.44%(95%CI,0.1-1.6)。2株鮑曼不動桿菌均對多種抗生素耐藥,且對小鼠有較強的致病性,LD50均達到7.09×107CFU/0.5 m L。這為研究鮑曼不動桿菌對禽類的致病性以及其感染的流行情況等提供了材料基礎。為了更好的認識禽源鮑曼不動桿菌的遺傳進化地位及其溯源,本研究基于管家基因rec A、gyr B、rpo B結合16S r RNA基因對2株禽源分離株進行系統(tǒng)發(fā)育分析。結果表明,進化樹分析發(fā)現(xiàn)2株禽源分離株與人源鮑曼不動桿菌遺傳距離最近,與大腸桿菌遺傳距離最遠,核苷酸同源性分析顯示禽源分離菌核苷酸同源性均與人源鮑曼不動桿菌的最高,高達92%-99.9%。以上結果說明禽源分離菌可能由人源菌株進化而來,這顯示了重要的公共衛(wèi)生意義。證明了rec A、gyr B、rpo B基因聯(lián)合16S r RNA基因可用于不動桿菌屬菌種鑒定,探索了一種鑒定該菌的新方法。通過設計特異性引物,擴增OmpA基因,克隆至原核表達載體p ET28a(+),構建重組質粒p ET28a-OmpA,轉化至BL21菌體進行誘導表達。通過條件摸索,確定最佳誘導條件,之后采用瓊脂糖Ni柱純化重組蛋白,并對其進行Western blot分析。SDS-PAGE結果表明,在37℃經(jīng)0.4 mmol/L IPTG誘導5 h的條件下,重組菌株能表達出約41 k Da的融合蛋白,與預期大小一致。Western blot分析顯示,該融合蛋白具有良好的免疫反應性。以上結果為進一步建立快速簡便的免疫學檢測方法和進行血清流行病學調查奠定基礎。以純化的OmpA蛋白作為抗原進行包板,建立了針對抗雞鮑曼不動桿菌抗體的間接ELISA檢測方法。本文所建立的ELISA方法具有良好的重復性和特異性,對來自河南不同地市的399份雞血清進行鮑曼不動桿菌抗體的檢測,結果顯示陽性率有3.75%。本研究所建立的ELISA方法可用于臨床樣品的血清學檢測,并為雞群中鮑曼不動桿菌的臨床診斷和流行病學調查提供了有效的檢測方法。
【關鍵詞】：鮑曼不動桿菌 流行病學 系統(tǒng)發(fā)育分析 OmpA蛋白 間接ELISA
【學位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 致謝4-9
• 英文縮寫詞表9-10
• 摘要10-11
• 文獻綜述11-22
• 1.1 不動桿菌的發(fā)現(xiàn)11
• 1.2 生長與培養(yǎng)特性11-12
• 1.3 流行病學調查12-15
• 1.4 鮑曼不動桿菌的毒力因素15-18
• 1.5 鮑曼不動桿菌診斷方法研究進展18-21
• 1.6 小結21-22
• 試驗研究22-58
• 試驗一 禽源鮑曼不動桿菌的分離鑒定22-29
• 1.1 材料22-23
• 1.1.1 病料來源及實驗動物22
• 1.1.2 培養(yǎng)基和主要試劑22-23
• 1.2 方法23-24
• 1.2.1 病原菌的分離培養(yǎng)與純化23
• 1.2.2 細菌生化鑒定23
• 1.2.3 特異性基因檢測23
• 1.2.4 細菌藥敏試驗23
• 1.2.5 小鼠致病性試驗23-24
• 1.3 結果24-26
• 1.3.1 細菌培養(yǎng)特性和鏡檢結果24-25
• 1.3.2 生化試驗結果25
• 1.3.3 特異性基因檢測25
• 1.3.4 藥敏試驗結果25-26
• 1.3.5 小鼠致病性試驗26
• 1.4 討論26-29
• 試驗二 禽源鮑曼不動桿菌的系統(tǒng)發(fā)育分析29-42
• 2.1 材料29-30
• 2.1.1 菌株29
• 2.1.2 主要儀器29
• 2.1.3 主要試劑29-30
• 2.2 方法30-31
• 2.2.1 引物設計30
• 2.2.2 細菌DNA的提取30
• 2.2.3 管家基因的PCR擴增30-31
• 2.2.4 管家基因的序列測定和分析31
• 2.2.5 基于管家基因的系統(tǒng)發(fā)育樹構建和同源性分析31
• 2.3 結果31-38
• 2.3.1 管家基因的PCR擴增31-32
• 2.3.2 PCR擴增產(chǎn)物的鑒定和測序結果32
• 2.3.3 基于4個管家基因的系統(tǒng)發(fā)育分析32-35
• 2.3.4 基于4個管家基因的同源性分析35-38
• 2.4 討論38-42
• 試驗三 禽源鮑曼不動桿菌OmpA基因的原核表達和免疫原性分析42-52
• 3.1 材料42-43
• 3.1.1 菌株，質粒和試驗動物42
• 3.1.2 主要儀器42-43
• 3.1.3 主要試劑43
• 3.2 方法43-45
• 3.2.1 引物的設計與合成43
• 3.2.2 細菌DNA的提取43
• 3.2.3 OmpA基因的擴增及序列分析43-44
• 3.2.4 原核表達載體的構建44
• 3.2.5 重組蛋白的表達44
• 3.2.6 重組蛋白的純化44-45
• 3.2.7 多克隆抗體的制備45
• 3.2.8 Western blot分析45
• 3.3 結果45-51
• 3.3.1 目的基因的擴增45-46
• 3.3.2 目的基因序列分析46-47
• 3.3.3 重組質粒pET28a-OmpA的雙酶切鑒定47-48
• 3.3.4 重組蛋白的表達與純化48-50
• 3.3.5 Western blot分析50-51
• 3.4 討論51-52
• 試驗四 基于禽源鮑曼不動桿菌OmpA蛋白的間接ELISA方法的建立及應用52-58
• 4.1.材料52-53
• 4.1.1 抗原與血清52
• 4.1.2 主要試劑和耗材52
• 4.1.3 主要儀器設備52
• 4.1.4 ELISA所需的試劑52-53
• 4.2 方法53-54
• 4.2.1 陽性血清的制備53
• 4.2.2 抗原的純化53
• 4.2.3 最佳抗原包被濃度和血清最佳稀釋度的確定53-54
• 4.2.4 最佳包板時間和溫度的確定54
• 4.2.5 最佳二抗稀釋比例的確定54
• 4.2.6 間接ELISA臨界值判斷標準的確定54
• 4.2.7 間接ELISA的特異性分析54
• 4.2.8 間接ELISA的重復性試驗54
• 4.2.9 間接ELISA的初步應用54
• 4.3 結果54-56
• 4.3.1 OmpA重組蛋白的純化54-55
• 4.3.2 最佳抗原包被濃度和血清最佳稀釋度55
• 4.3.3 最佳抗原包被時間和溫度55
• 3.3.4 最佳二抗稀釋比例55
• 4.3.5 臨界值判斷標準的確定55
• 4.3.6 特異性分析55-56
• 4.3.7 重復性試驗56
• 4.3.8 初步應用56
• 4.4 討論56-58
• 全文總結58-59
• 參考文獻59-72
• 附：作者讀研期間發(fā)表文章72-73
• ABSTRACT73-74

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