本文關(guān)鍵詞：檢測犬弓形蟲感染ELISA和膠體金試紙條方法的建立

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【摘要】：弓形蟲屬于細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲。弓形蟲病是一類由弓形蟲引起的對絕大多數(shù)脊椎動物包括人在內(nèi)的具有嚴(yán)重危害的人獸共患疾病。弓形蟲可以自然感染人、犬等是數(shù)百種動物。由于犬?dāng)?shù)量龐大,且與人的關(guān)系最為密切,所以犬弓形蟲感染率與人的感染率息息相關(guān)。針對弓形蟲病的研究技術(shù)眾多,但因免疫學(xué)診斷方法敏感性高、特異性強(qiáng)、簡便實(shí)用,所以應(yīng)用廣泛。本研究以犬作為研究對象,利用免疫學(xué)診斷技術(shù)建立檢測犬弓形蟲感染的方法。本試驗(yàn)成功建立了以SAG3重組蛋白為抗原用以檢測犬血清弓形蟲SAG3抗體的間接ELISA方法;和用42#抗弓形蟲SAG3單抗為捕獲抗體、29#抗弓形蟲SAG3單抗作為檢測抗體的檢測犬弓形蟲CAg的雙抗體夾心ELISA的方法;以及用42#抗弓形蟲SAG3單抗為捕獲抗體、29#抗弓形蟲SAG3單抗作為檢測抗體用以檢測犬弓形蟲CAg的膠體金試紙條方法。3個試驗(yàn)得到的結(jié)果如下:1.犬弓形蟲感染的間接ELISA檢測方法的建立。借助于棋盤滴定法確定抗原的包被濃度和陽性血清稀釋度;再對該方法的封閉劑以及封閉時間、犬弓形蟲陽性血清孵育的時間、二抗的工作濃度以及顯色液的孵育時間等各項(xiàng)條件進(jìn)行優(yōu)化;并采用優(yōu)化后ELISA方法檢驗(yàn)其敏感性;借助于犬的心絲蟲、等孢球蟲、蛔蟲及巴貝斯蟲陽性血清檢測該ELISA方法的特異性;同時檢驗(yàn)該ELISA方法的重復(fù)性;運(yùn)用所建立的間接ELISA方法對87份樣品血清進(jìn)行檢測。結(jié)果如下,該間接ELISA最佳優(yōu)化條件分別是:抗原的包被濃度和陽性血清稀釋度分別為0.82μg/孔,陽性血清稀釋度1:20;封閉劑為10%胎牛血清的PBST溶液;最佳封閉時間和陽性血清作用時間分別為2 h和1.5 h;兔抗犬酶標(biāo)二抗稀釋度1:8000;底物最佳顯色孵育時間為10 min。優(yōu)化的ELISA敏感性為1:1280;與犬的心絲蟲、等孢球蟲、蛔蟲及巴貝斯蟲陽性血清之間均無交叉反應(yīng);批內(nèi)批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均于15%以下。經(jīng)該ELISA方法對所有樣品血清檢測可得血清陽性率為18.39%(16/87)。2.檢測犬弓形蟲感染雙抗體夾心ELISA方法的建立。利用HRP標(biāo)記試劑盒標(biāo)記29#抗弓形蟲SAG3單克隆抗體即檢測抗體并檢測標(biāo)記結(jié)果;借助于棋盤滴定法確定42#抗弓形蟲SAG3單抗即捕獲抗體的包被濃度和參考陽性血清的稀釋度;再對該方法的封閉劑以及封閉劑的作用時間、犬弓形蟲參考陽性血清孵育的時間、檢測抗體的工作濃度以及顯色液的孵育時間等各項(xiàng)條件進(jìn)行優(yōu)化;隨后采用優(yōu)化后ELISA方法檢驗(yàn)其敏感性;采用犬的心絲蟲、等孢球蟲、蛔蟲及巴貝斯蟲陽性血清檢測該ELISA方法的特異性;同時檢驗(yàn)該ELISA方法的重復(fù)性,ELISA包被板保存4oC中,分別于15d、30d、60d以及90d后取出檢測其穩(wěn)定性;用所建立的雙抗體夾心ELISA方法對76份樣品血清進(jìn)行檢測。結(jié)果如下,本試驗(yàn)成功標(biāo)記檢測抗體;該方法最佳優(yōu)化條件分別是:捕獲抗體的包被濃度和參考陽性血清的稀釋度分別為1∶800稀釋(0.34μg/孔)和1∶12;封閉劑為10%胎牛血清的PBST溶液;最佳封閉時間和CAg血清作用時間均為2 h;檢測抗體稀釋度1∶3000。優(yōu)化的ELISA敏感性為1∶48;與犬心絲蟲陽性血清、犬等孢球蟲陽性血清、犬蛔蟲陽性血清及犬巴貝斯蟲陽性血清之間均無交叉反應(yīng);批內(nèi)批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均于15%以下;保存于4oC中的ELISA包被板穩(wěn)定性至少可達(dá)到90 d以上;經(jīng)該雙抗體夾心ELISA方法對76樣品血清檢測可得檢出率為5.26%(4/76)。3.犬弓形蟲感染膠體金試紙條的研制。該試驗(yàn)主要對金標(biāo)蛋白pH值、硝酸纖維膜的選擇、弓形蟲參考陽性血清稀釋度以及試紙條檢測線T線和質(zhì)控線C線條件的等條件進(jìn)行優(yōu)化;并采用優(yōu)化的膠體金試紙條方法檢驗(yàn)其敏感性;采用犬的心絲蟲、等孢球蟲、蛔蟲及巴貝斯蟲陽性血清檢測該膠體金試紙條方法的特異性;同時檢驗(yàn)該方法的重復(fù)性;再用所建立的膠體金試紙條方法對76份樣品血清進(jìn)行檢測,并與建立的雙抗體夾心ELISA所檢測樣品結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果如下,該膠體金試紙條方法最佳優(yōu)化條件分別為:0.02 M K2CO3 4μL;密理博135 NC膜為最佳選擇且流速大約為40 mm/7 min;參考陽性血清工作濃度為1∶8;T線、C線抗體稀釋度均為0.5μg/μL;優(yōu)化的膠體金試紙條方法的敏感性為1∶64;與犬心絲蟲陽性血清、犬等孢球蟲陽性血清、犬蛔蟲陽性血清及犬巴貝斯蟲陽性血清與弓形蟲參考陽性血清均無特異性反應(yīng);批內(nèi)批間重復(fù)性較好。用膠體金試紙條方法檢測76份樣品血清樣本,結(jié)果顯示檢出率為5.26%(4/76)。通過與雙抗體夾心ELISA檢測的檢出率5.26%(4/76)相比較,結(jié)果顯示兩種試驗(yàn)方法對犬弓形蟲血清CAg診斷相符率100%,說明該膠體金試紙條方法可靠性強(qiáng),兼?zhèn)浜啽恪⒖焖俚膬?yōu)點(diǎn),更適于在基層推廣使用。
【關(guān)鍵詞】：犬 弓形蟲 ELISA 膠體金 試紙條
【學(xué)位授予單位】：天津農(nóng)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.292
【目錄】：

• 中文摘要10-12
• Abstract12-15
• 前言15-16
• 第一章 文獻(xiàn)綜述16-29
• 1.1 弓形蟲病的研究進(jìn)展16-24
• 1.2 弓形蟲相關(guān)蛋白質(zhì)的研究進(jìn)展24-28
• 1.3 本研究的目的及意義28-29
• 第二章 犬弓形蟲感染間接ELISA檢測方法的建立29-43
• 2.1 材料29-32
• 2.2 方法32-35
• 2.3 結(jié)果35-40
• 2.4 討論40-41
• 2.5 小結(jié)41-43
• 第三章 檢測犬弓形蟲感染雙抗體夾心ELISA方法的建立43-55
• 3.1 材料43-44
• 3.2 方法44-47
• 3.3 結(jié)果47-52
• 3.4 討論52
• 3.5 小結(jié)52-55
• 第四章 犬弓形蟲感染膠體金試紙條的研制55-67
• 4.1 材料55-56
• 4.2 方法56-59
• 4.3 結(jié)果59-64
• 4.4 討論64-65
• 4.5 小結(jié)65-67
• 全文結(jié)論67-69
• 參考文獻(xiàn)69-73
• 致謝73-75
• 附錄 常用縮略語中英文對照表75-76
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文76

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：710355