本文關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒S1蛋白間接ELISA方法的建立與應(yīng)用及卵黃抗體的制備

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【摘要】：豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)是豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一種高度接觸性的消化道傳染病,主要引起病豬嘔吐、急性水樣腹瀉、脫水以及仔豬的高死亡率等癥狀。各個年齡階段的豬群均可造成PED感染,傳播速度快,仔豬的發(fā)病率、死亡率很高,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。近年來PED的流行趨勢不斷擴大,已經(jīng)在世界范圍內(nèi)造成嚴重影響。為了更好地防治該病,本研究分離到一株P(guān)EDV病毒(PEDV-HN/01);以截短表達的S1蛋白建立了具有良好特異性和敏感性的間接ELISA方法;制備了具有良好中和效果的卵黃抗體。本研究分為三部分:1豬流行性腹瀉病毒的分離和鑒定本研究通過對采集的病料接種到含終濃度6ug/ml胰酶的Vero細胞上進行分離傳代,盲傳到4代后出現(xiàn)局灶性細胞病變。通過對S1基因序列分析,該毒株與經(jīng)典株CV777相比發(fā)生了變異,與美國、韓國毒株關(guān)系較遠,同源性分別為91.9㳠、91.8㳠。該病毒能使Vero細胞產(chǎn)生空泡、融合病變,對第20代病毒TCID50測定結(jié)果為10-4.3/0.1ml。將病毒的細胞培養(yǎng)產(chǎn)物應(yīng)用RT-PCR、間接免疫熒光、動物回歸試驗進行鑒定。證明所分離到的病毒為PEDV,并將其命名為PEDV-HN/01。2 PEDV S1基因截短克隆表達及間接ELISA方法的建立本試驗以PEDV-HN/01株P(guān)MD-18T-S1質(zhì)粒為模板,設(shè)計引物,成功地克隆出S1截短基因并連接到原核表達載體PET-32a(+)中,構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒PET-32a-t S1,經(jīng)測序鑒定正確后,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞BL21(DE3)中,并進行IPTG誘導(dǎo)表達。對重組的表達蛋白用鎳離子親和層析法純化,Western-blotting檢測表明:表達的S1蛋白能與PEDV陽性血清發(fā)生特異性的免疫反應(yīng),表明原核表達的S1蛋白具有良好的反應(yīng)原性。以原核表達的重組S1蛋白作為檢測抗原,優(yōu)化ELISA反應(yīng)條件,建立了PEDV間接ELISA抗體檢測方法。其反應(yīng)條件為:抗原最佳包被濃度為5.13μg/m L,血清樣品最佳稀釋度為1:100,包被時間為4℃作用12h,1.0%BSA 37℃封閉1h,二抗1:4000稀釋,37℃作用1h,底物液顯色時間為10 min,抗體臨界值為D450 nm≥0.338判為陽性,D450 nm0.338判為陰性,該方法特異性強,該方法僅對PEDV血清檢測為陽性,對豬傳染性胃腸炎、偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬細小病毒、豬瘟病毒感染豬的陽性血清檢測結(jié)果均為陰性;其批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗的變異系數(shù)為1.06%~6.81%。在敏感性試驗中,當(dāng)陽性血清稀釋至6400倍時,雖然顯色后靠肉眼觀察難以判斷陰、陽性結(jié)果,但酶標儀仍可以檢測出為陽性。對50份疑似豬流行性腹瀉血清樣品進行檢測,該方法與商品試劑盒的符合率為94.0%。選20份用建立的ELISA方法檢測的陽性血清進行病毒中和試驗,結(jié)果表明兩者具有較好的相關(guān)性。采用建立的ELISA方法檢測了河南、河北、安徽、山東地區(qū)臨床樣品,抗體陽性達到42.00%。結(jié)果表明建立的以重組S1蛋白為包被抗原檢測PEDV血清抗體的方法可以用于PEDV抗體檢測及疫苗免疫效果評價。3 PEDV卵黃抗體的制備本試驗利用分離到的PEDV-HN/01細胞毒種,成功制備3000ml Vero細胞病毒培養(yǎng)物,用超濾濃縮儀器進行濃縮、過濾。利用凝膠層析方法純化超濾后的病毒,-80℃保存,對收集的病毒液進行SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示細胞毒里的小牛血清已被除去,表明該方法具有良好的純化效果。將純化后細胞毒與蜂膠佐劑按比例混合,作為免疫抗原,免疫產(chǎn)蛋雞,每隔兩周免疫,共免疫3次,定期利用ELISA方法檢測抗體效價水平變化趨勢。瓊脂擴散試驗抗體效價最高達到最高時,收集并純化卵黃抗體(Ig Y),SDS-PAGE結(jié)果分析純化效果較好。將卵黃抗體與CV777疫苗毒進行中和試驗,結(jié)果測得體外中和抗體的效價為PD50=10-2.1/0.1ml。結(jié)果表明本研究純化濃縮后的病毒具有良好的免疫原性,作為免疫抗原免疫產(chǎn)生的卵黃抗體具有較高的抗體效價,為進一步研制豬流行性腹瀉卵黃抗體生物制劑奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：豬流行性腹瀉病毒 分離鑒定 S1基因 間接ELISA 卵黃抗體
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 符號及縮略詞4-8
• 中文摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 1 前言12-26
• 1.1 豬流行性腹瀉的研究進展12-21
• 1.1.1 PEDV的形態(tài)結(jié)構(gòu)和理化特性12-13
• 1.1.2 PEDV的分子生物學(xué)特點13-15
• 1.1.3 豬流行性腹瀉流行病學(xué)15-17
• 1.1.4 PEDV的培養(yǎng)特性17
• 1.1.5 豬流行性腹瀉臨床癥狀和病理變化17-18
• 1.1.6 豬流行性腹瀉病毒診斷檢測方法18-20
• 1.1.7 疫苗開發(fā)進展20-21
• 1.2 卵黃抗體的研究進展21-24
• 1.2.1 卵黃抗體的形成21-22
• 1.2.2 卵黃抗體的結(jié)構(gòu)22
• 1.2.3 卵黃抗體的理化特性22-23
• 1.2.4 卵黃抗體的優(yōu)勢23
• 1.2.5 卵黃抗體在豬生產(chǎn)上的應(yīng)用23
• 1.2.6 卵黃抗體在豬流行性腹瀉上的應(yīng)用23-24
• 1.3 本研究的目的和意義24-26
• 2 材料與方法26-44
• 2.1 豬流行性腹瀉病毒的分離鑒定材料與方法26-33
• 2.1.1 材料26-27
• 2.1.2 方法27-33
• 2.2 豬流行性腹瀉重組S蛋白間接ELISA檢測方法的建立與應(yīng)用的材料與方法33-40
• 2.2.1 材料33-35
• 2.2.2 方法35-40
• 2.3 豬流行性腹瀉卵黃抗體的制備的材料與方法40-44
• 2.3.1 材料40-41
• 2.3.2 方法41-44
• 3 結(jié)果與分析44-65
• 3.1 豬流行性腹瀉病毒的分離鑒定結(jié)果44-50
• 3.1.1 病毒分離結(jié)果44
• 3.1.2 S1基因序列分析44-47
• 3.1.3 RT-PCR鑒定結(jié)果47-48
• 3.1.4 Vero細胞胰酶適應(yīng)性結(jié)果48
• 3.1.5 細胞病變結(jié)果48-49
• 3.1.6 TCID50的測定結(jié)果49
• 3.1.7 間接免疫熒光實驗49-50
• 3.1.8 動物回歸試驗50
• 3.2 豬流行性腹瀉重組S蛋白間接ELISA檢測方法的建立與應(yīng)用結(jié)果50-60
• 3.2.1 PEDV tS1截短基因擴增結(jié)果50-51
• 3.2.2 pMD18-T-tS1截短重組質(zhì)粒雙酶切鑒定51
• 3.2.3 pET-32a-tS1截短表達質(zhì)粒雙酶切鑒定51-52
• 3.2.4 重組S1蛋白的誘導(dǎo)表達和純化52-53
• 3.2.5 重組的S1蛋白Western-blotting分析53-54
• 3.2.6 間接ELISA條件優(yōu)化結(jié)果54-56
• 3.2.7 間接ELISA判斷標準的確定56
• 3.2.8 特異性試驗56-57
• 3.2.9 敏感性試驗57
• 3.2.10 重復(fù)性試驗57-58
• 3.2.11 穩(wěn)定性試驗58
• 3.2.12 符合性試驗58-60
• 3.2.13 臨床檢測結(jié)果60
• 3.3 豬流行性腹瀉卵黃抗體的制備結(jié)果60-65
• 3.3.1 Vero細胞接毒變化60
• 3.3.2 病毒純化鑒定60-61
• 3.3.3 卵黃抗體及血清效價水平檢測61-62
• 3.3.4 卵黃抗體SDS-PAGE分析62
• 3.3.5 卵黃抗體濃度的測定及效價檢測62
• 3.3.6 無菌檢驗結(jié)果62
• 3.3.7 卵黃抗體的中和試驗62-64
• 3.3.8 卵黃抗體中和效價與ELISA檢測結(jié)果比較64-65
• 4 討論65-68
• 4.1 豬流行性腹瀉病毒的分離鑒定65-66
• 4.2 豬流行性腹瀉重組S1蛋白間接ELISA檢測方法的建立與應(yīng)用66-67
• 4.3 豬流行性腹瀉卵黃抗體的制備67-68
• 5 結(jié)論68-69
• 6 參考文獻69-77
• 7 致謝77-78
• 8 攻讀碩士期間發(fā)表論文情況78

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