本文關(guān)鍵詞：新疆哈薩克羊TLR8基因突變與綿羊肺腺瘤病毒易感性關(guān)系研究

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【摘要】：Toll樣受體(TLRs)是一種模式識(shí)別受體(pattern recognize receptor,PRR),由14個(gè)TLR成員組合而成,在先天性以及適應(yīng)性免疫中扮演著重要的角色�，F(xiàn)今已知TLR2,TLR3,TLR4和TLR7,TLR8,TLR9可引發(fā)抗病毒防御機(jī)制。綿羊肺腺瘤病(ovine pulmonary adenomatosis,OPA)是由綿羊肺腺瘤反轉(zhuǎn)錄病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)引起的一種慢性、接觸傳染性肺臟腫瘤性疾病,嚴(yán)重影響著全世界養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。目前,Toll樣受體和其它免疫應(yīng)答基因的多態(tài)性已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)與疾病抵抗力和易感性緊密相關(guān)。本研究使用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)新疆哈薩克羊TLR8基因多態(tài)性進(jìn)行了分析,選取3只突變以及3只未突變的哈薩克羊進(jìn)行綿羊肺腺瘤病毒感染實(shí)驗(yàn),并且對(duì)其早期感染的炎性細(xì)胞及免疫細(xì)胞因子的水平進(jìn)行了檢測(cè),在攻毒5個(gè)月后進(jìn)行病理剖檢觀察和組織學(xué)觀察,進(jìn)一步探討哈薩克羊TLR8基因突變與綿羊肺腺瘤病毒的易感性關(guān)系,為綿羊抗病選育提供理論支持。1.新疆哈薩克羊TLR8基因多態(tài)性分析采用PCR-SSCP方法對(duì)其突變進(jìn)行了檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)P1、P5、P6三對(duì)引物所擴(kuò)增的片段存在多態(tài)性,檢測(cè)到4個(gè)突變位點(diǎn),分別為G170A、G1307A、T1604C和A1628G,其中,G170A和G1307A為同義突變,T1604C和A1628G為錯(cuò)義突變,對(duì)應(yīng)的氨基酸改變分別是Leu496Pro和Gln504Arg。對(duì)基因型頻率和等位基因頻率進(jìn)行了計(jì)算,Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)結(jié)果為非平衡狀態(tài)。2.哈薩克羊TLR8基因SNP突變對(duì)綿羊肺腺瘤病毒侵染后細(xì)胞因子影響利用患病羊肺臟組織制備綿羊肺腺瘤病毒懸液,進(jìn)行綿羊肺腺瘤病感染實(shí)驗(yàn),然后檢測(cè)血液各項(xiàng)指標(biāo)的變化,并用ELISA方法檢測(cè)其感染早期炎性因子的水平。結(jié)果表明,制備病毒懸液經(jīng)電鏡觀察,病毒直徑約為80-100nm之間,綿羊肺腺瘤病毒接種后,每隔3小時(shí)測(cè)定的呼吸、脈搏等生理指標(biāo)均未出現(xiàn)異常。血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果顯示突變組與對(duì)照組綿羊的白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞都處于升高趨勢(shì),但組間差異并不顯著。ELISA結(jié)果顯示,突變組血清中γ-IFN、IL1-β及TNF-α水平均低于對(duì)照組,且組間差異顯著。而突變組中TLR8和My D88的含量高于對(duì)照組,但組間差異不顯著。本實(shí)驗(yàn)選取突變羊?qū)嵤└腥緦?shí)驗(yàn),通過(guò)對(duì)感染早期幾個(gè)細(xì)胞因子水平的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)TLR8基因突變的綿羊在接種病毒后炎性細(xì)胞因子水平低于未突變組,推測(cè)可能是由于TLR8基因SNP突變阻礙了機(jī)體免疫應(yīng)答,以致于抗病毒、抗感染免疫受阻,從而導(dǎo)致病毒侵染機(jī)體后免疫調(diào)節(jié)減弱。3.人工感染綿羊肺腺瘤病后的病理學(xué)觀察在感染綿羊肺腺瘤病毒5個(gè)月后,將突變組和對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)羊解剖,觀察其肺臟的病變情況,取肺病變組織制成切片在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察。對(duì)比攻毒后突變組和對(duì)照組的病理?yè)p傷程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變組綿羊的肺臟質(zhì)地變實(shí),有許多灰白色結(jié)節(jié),形似腫瘤灶,并出現(xiàn)增生融合的腫塊。而對(duì)照組綿羊的肺葉中僅出現(xiàn)了少量疑似腫瘤灶的結(jié)節(jié),肺臟損傷程度低于突變組的綿羊。病理切片觀察發(fā)現(xiàn),突變組綿羊肺臟組織有大量形狀不規(guī)則的腺瘤病灶,而對(duì)照組僅有少量支氣管腔內(nèi)出現(xiàn)腺瘤灶,多數(shù)肺泡仍保持原有的結(jié)構(gòu)。綜上所述,TLR8突變組的綿羊感染綿羊肺腺瘤病毒的病理?yè)p傷程度高于對(duì)照組綿羊,哈薩克羊TLR8基因突變對(duì)綿羊肺腺瘤病毒的易感性更強(qiáng)。
【關(guān)鍵詞】：TLR8基因 綿羊肺腺瘤病 多態(tài)性 易感性
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.26
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-11
• 第一章 文獻(xiàn)綜述11-19
• 1.綿羊肺腺瘤病11-14
• 1.1. 綿羊肺腺瘤病概述11
• 1.2 綿羊肺腺瘤病的發(fā)現(xiàn)11
• 1.3 綿羊肺腺瘤病的流行病學(xué)11-12
• 1.3.1 易感動(dòng)物12
• 1.3.2 傳染源及傳播途徑12
• 1.4 綿羊肺腺瘤病的臨床癥狀及病理變化12-13
• 1.4.1 臨床癥狀12-13
• 1.4.2 病理組織學(xué)觀察13
• 1.5 綿羊肺腺瘤的診斷13-14
• 1.5.1 病原鑒定14
• 1.6 綜合防治14
• 2. Toll樣受體14-17
• 2.1. Toll樣受體家族概述14-15
• 2.2. Toll樣受體分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)15
• 2.3. Toll樣受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑15-16
• 2.4. Toll樣受體的配體16-17
• 2.5. TLR8的免疫學(xué)功能17
• 3. PCR-SSCP技術(shù)17-19
• 3.1. PCR-SSCP技術(shù)概述17
• 3.2.PCR-SSCP技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用前景17-18
• 3.3 基因突變的研究意義18-19
• 第二章 實(shí)驗(yàn)部分19-42
• 實(shí)驗(yàn)一 新疆哈薩克羊TLR8基因多態(tài)性分析19-28
• 1.材料與方法20-24
• 1.1 試驗(yàn)材料20-21
• 1.1.1 動(dòng)物樣品來(lái)源20
• 1.1.2 主要試劑20
• 1.1.3 試劑的配置20
• 1.1.4 儀器20-21
• 1.2 試驗(yàn)方法21-24
• 1.2.1 引物設(shè)計(jì)21
• 1.2.2 引物稀釋21
• 1.2.3 提取基因組DNA21-22
• 1.2.4 PCR擴(kuò)增22
• 1.2.5 PCR-SSCP分析22-23
• 1.2.6 PCR產(chǎn)物回收23
• 1.2.7 目的片段與載體的連接轉(zhuǎn)化23
• 1.2.8 菌落PCR檢測(cè)23-24
• 1.2.9 質(zhì)粒的提取24
• 1.2.10 PCR產(chǎn)物測(cè)序24
• 1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析24
• 2. 結(jié)果與分析24-26
• 2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果24-25
• 2.2 PCR-SSCP分型結(jié)果25
• 2.3 測(cè)序結(jié)果25-26
• 2.4 哈薩克羊TLR8基因的基因型頻率、基因頻率分析26
• 3. 討論26-28
• 實(shí)驗(yàn)二 哈薩克羊TLR8基因SNP突變對(duì)綿羊肺腺瘤病毒侵染后細(xì)胞因子影響28-35
• 1. 材料與方法29-30
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料29
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料29
• 1.1.2 主要試劑29
• 1.1.3 儀器29
• 1.2 試驗(yàn)方法29-30
• 1.2.1 綿羊肺腺瘤病毒的制備29
• 1.2.2 攻毒實(shí)驗(yàn)29-30
• 1.2.3 血常規(guī)測(cè)定方法30
• 1.2.4 細(xì)胞因子的檢測(cè)30
• 2. 結(jié)果30-34
• 2.1 病毒懸液的電鏡觀察30-31
• 2.2 血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果31-33
• 2.3 細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果33-34
• 3. 討論34-35
• 實(shí)驗(yàn)三 人工感染綿羊肺腺瘤病毒的病理學(xué)觀察35-42
• 1.材料與方法36-37
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料36
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料36
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑36
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法36-37
• 1.2.1 剖檢觀察36
• 1.2.2 組織病理切片觀察36-37
• 2.結(jié)果37-40
• 2.1 剖檢觀察37-38
• 2.2 病理組織學(xué)觀察38-40
• 3.討論40-42
• 結(jié)論42-43
• 參考文獻(xiàn)43-51
• 致謝51-52
• 導(dǎo)師評(píng)閱表52

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