本文關(guān)鍵詞：ABCG2基因?qū)δ膛Ｈ橄偕掀ぜ?xì)胞轉(zhuǎn)運黃曲霉毒素M1的影響

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【摘要】：黃曲霉毒素(AF)被劃定為I類致癌物,黃曲霉毒素B1(AFB1)是一種主要的黃曲霉毒素,其污染物大大降低了食物的安全水平,對人類的健康有重大的威脅。黃曲霉毒素M1(AFM1)是AFB1的二次毒性代謝產(chǎn)物,奶牛攝入被AFB1污染的飼料,15min后可在血液中檢測到AFM1,8h后可在奶中檢測到AFM1。部分AFM1會隨乳汁、尿液排出,一部分則留在動物的可食用的組織和器官如血、腎、肝等。AFM1在乳汁中最為常見,這使得牛奶及其奶制品成為易受AFM1污染的食品。因此深入研究奶牛血乳屏障對AFM1攝取的機理,將有助于有效地減少奶牛乳腺上皮細(xì)胞對血液循環(huán)中AFM1的攝取,從而保證我國牛奶以及奶制品的質(zhì)量安全。為了研究奶牛血乳屏障對AFM1的攝取方式以及轉(zhuǎn)運AFM1的分子機理,本實驗采用中國荷斯坦奶牛乳腺上皮細(xì)胞進行原代培養(yǎng),細(xì)胞以1×106個/mL的密度接種在Transwell小室的聚碳酸酯膜上,在體外構(gòu)建了奶牛血乳屏障模型。在體外構(gòu)建的奶牛血乳屏障是由單一的乳腺上皮細(xì)胞增殖而來。激光掃描共聚焦結(jié)果顯示,乳腺上皮細(xì)胞之間形成了較好的緊密連接,而且乳腺上皮細(xì)胞仍具有合成酪蛋白的功能。所以在體外構(gòu)建的奶牛血乳屏障模型可以成為體外研究藥物在血乳屏障中轉(zhuǎn)運機理的模型。為了研究奶牛乳腺上皮細(xì)胞對AFM1的攝取方式,通過采用熒光定量PCR檢測了在培養(yǎng)體系中添加AFM1對體外構(gòu)建的奶牛血乳屏障中ABCG2、ABCC5、ABCC1、ABCB1、ABCC3、5-HT、SLC22A5和SLC22A4基因mRNA表達(dá)量的影響,結(jié)果顯示在血乳屏障中ABCG2和ABCB1表達(dá)量較高,有可能參與AFM1在血乳屏障中的轉(zhuǎn)運。同時,我們也采用Western blotting方法檢測了在培養(yǎng)體系中添加AFM1對ABCG2和ABCB1蛋白表達(dá)量的影響,結(jié)果顯示與不添加AFM1培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞相比,ABCG2和ABCB1蛋白表達(dá)量顯著提高(P0.01),這種結(jié)果更大程度上表明ABCG2和ABCB1轉(zhuǎn)運蛋白參與AFM1轉(zhuǎn)運的可能性。為了進一步研究ABCG2對AFM1轉(zhuǎn)運作用的影響,試驗構(gòu)建重組質(zhì)粒pGCMV-ABCG2-IRES-EGFP對細(xì)胞進行瞬時轉(zhuǎn)染,從而進行ABCG2基因的過表達(dá)試驗研究;同時應(yīng)用RNA干擾的方法用ABCG2 si RNA對細(xì)胞進行瞬時轉(zhuǎn)染,從而進行ABCG2基因的抑制試驗研究。再通過采用熒光定量PCR和Western blotting檢測在培養(yǎng)體系中添加AFM1對體外構(gòu)建的奶牛血乳屏障中轉(zhuǎn)運蛋白ABCG2 mRNA和蛋白表達(dá)量的影響,同時采用液相色譜法對收集的細(xì)胞和Transwell上室的培養(yǎng)液中AFM1的含量進行檢測。熒光定量PCR和Western blotting結(jié)果顯示:ABCG2基因的過表達(dá)和抑制對ABCG2 mRNA和蛋白表達(dá)量均有極顯著性影響(P0.01),而對β-酪蛋白的表達(dá)均無顯著性影響(P0.05)。AFM1液相色譜結(jié)果顯示:ABCG2基因過表達(dá)上調(diào)細(xì)胞以及上室培養(yǎng)液中AFM1的含量(P0.01),ABCG2基因抑制下調(diào)細(xì)胞以及上室培養(yǎng)液中AFM1的含量(P0.01)。綜上所述,ABCG2基因參與了AFM1轉(zhuǎn)運的過程,但未參與奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳和細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)。對于ABCG2基因參與AFM1轉(zhuǎn)運機理還需進行深入的研究。
【關(guān)鍵詞】：奶牛 血乳屏障 AFM1 轉(zhuǎn)運蛋白 ABCG2基因
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S823
【目錄】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 前言12-18
• 1.1 黃曲霉毒素的研究進展12-14
• 1.1.1 黃曲霉毒素研究的背景12
• 1.1.2 AFM1及其毒性的研究12-13
• 1.1.3 AFM1穩(wěn)定性的研究13-14
• 1.1.4 牛奶及其他奶制品中AFM1的規(guī)范要求14
• 1.2 血乳屏障的研究進展14-16
• 1.2.1 上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的研究14
• 1.2.2 乳房炎對血乳屏障影響的研究14-15
• 1.2.3 血乳屏障模型的體外構(gòu)建研究進展15-16
• 1.3 藥物轉(zhuǎn)運蛋白的研究概況16-17
• 1.4 研究的目的與意義17-18
• 2 材料與方法18-29
• 2.1 主要的實驗材料、儀器與試劑18
• 2.1.1 實驗材料18
• 2.1.2 實驗儀器18
• 2.1.3 實驗試劑18
• 2.2 實驗方法18-29
• 2.2.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)18-19
• 2.2.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的鑒定19
• 2.2.3 篩選奶牛乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的最佳接種密度19-22
• 2.2.4 體外血乳屏障模型的構(gòu)建22
• 2.2.5 AFM1對乳腺上皮細(xì)胞外源性化合物轉(zhuǎn)運蛋白的影響22-25
• 2.2.6 ABCG2基因過表達(dá)對奶牛乳腺上皮細(xì)胞的影響25-27
• 2.2.7 ABCG2基因抑制對奶牛乳腺上皮細(xì)胞的影響27-28
• 2.2.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析28-29
• 3 結(jié)果與分析29-50
• 3.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定29-32
• 3.1.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的純化與鑒定29
• 3.1.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞角蛋白18的鑒定29-30
• 3.1.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞最佳接種密度的篩選30-31
• 3.1.4 奶牛乳腺上皮細(xì)胞生長曲線的測定31-32
• 3.2 奶牛血乳屏障體外的構(gòu)建與鑒定32-33
• 3.2.1 倒置顯微鏡下觀察奶牛乳腺上皮細(xì)胞32
• 3.2.2 掃描電鏡下觀察奶牛乳腺上皮細(xì)胞32-33
• 3.2.3 免疫熒光染色檢測緊密連接蛋白ZO-133
• 3.3 AFM1對奶牛乳腺上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)的影響33-37
• 3.3.1 AFM1的劑量關(guān)系33-34
• 3.3.2 AFM1的時間關(guān)系34
• 3.3.3 AFM1對ABCB1和ABCG2蛋白表達(dá)水平的影響34-35
• 3.3.4 AFM1對β-酪蛋白的蛋白表達(dá)水平的影響35-36
• 3.3.5 AFM1對奶牛乳腺上皮細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響36-37
• 3.4 ABCG2基因過表達(dá)的實驗結(jié)果37-43
• 3.4.1 去內(nèi)毒素質(zhì)粒的雙酶切法驗證37-38
• 3.4.2 最佳轉(zhuǎn)染時間的篩選38
• 3.4.3 ABCG2基因過表達(dá)轉(zhuǎn)染效率的檢測38-39
• 3.4.4 ABCG2基因過表達(dá)對奶牛乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運AFM1的影響39-42
• 3.4.5 ABCG2基因過表達(dá)對奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳功能的影響42
• 3.4.6 ABCG2基因過表達(dá)對奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖作用的影響42-43
• 3.5 ABCG2基因抑制的實驗結(jié)果43-50
• 3.5.1 ABCG2 siRNA最佳干擾片段和最佳干擾時間43-44
• 3.5.2 干擾效率的檢測44-45
• 3.5.3 ABCG2基因抑制對奶牛乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運AFM1的影響45-48
• 3.5.4 ABCG2基因抑制對奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳功能的影響48
• 3.5.5 ABCG2基因抑制對奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖作用的影響48-50
• 4 討論50-53
• 4.1 奶牛血乳屏障的建立與鑒定50-51
• 4.2 AFM1對奶牛乳腺上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)運蛋白的影響51
• 4.3 ABCG2基因過表達(dá)與抑制對AFM1在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)運的影響51-53
• 5 結(jié)論53-54
• 致謝54-55
• 參考文獻55-64
• 附錄64-65
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文65

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本文編號：534410