本文關鍵詞：ABCG2基因對奶牛乳腺上皮細胞轉運黃曲霉毒素M1的影響

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【摘要】：黃曲霉毒素(AF)被劃定為I類致癌物,黃曲霉毒素B1(AFB1)是一種主要的黃曲霉毒素,其污染物大大降低了食物的安全水平,對人類的健康有重大的威脅。黃曲霉毒素M1(AFM1)是AFB1的二次毒性代謝產(chǎn)物,奶牛攝入被AFB1污染的飼料,15min后可在血液中檢測到AFM1,8h后可在奶中檢測到AFM1。部分AFM1會隨乳汁、尿液排出,一部分則留在動物的可食用的組織和器官如血、腎、肝等。AFM1在乳汁中最為常見,這使得牛奶及其奶制品成為易受AFM1污染的食品。因此深入研究奶牛血乳屏障對AFM1攝取的機理,將有助于有效地減少奶牛乳腺上皮細胞對血液循環(huán)中AFM1的攝取,從而保證我國牛奶以及奶制品的質量安全。為了研究奶牛血乳屏障對AFM1的攝取方式以及轉運AFM1的分子機理,本實驗采用中國荷斯坦奶牛乳腺上皮細胞進行原代培養(yǎng),細胞以1×106個/mL的密度接種在Transwell小室的聚碳酸酯膜上,在體外構建了奶牛血乳屏障模型。在體外構建的奶牛血乳屏障是由單一的乳腺上皮細胞增殖而來。激光掃描共聚焦結果顯示,乳腺上皮細胞之間形成了較好的緊密連接,而且乳腺上皮細胞仍具有合成酪蛋白的功能。所以在體外構建的奶牛血乳屏障模型可以成為體外研究藥物在血乳屏障中轉運機理的模型。為了研究奶牛乳腺上皮細胞對AFM1的攝取方式,通過采用熒光定量PCR檢測了在培養(yǎng)體系中添加AFM1對體外構建的奶牛血乳屏障中ABCG2、ABCC5、ABCC1、ABCB1、ABCC3、5-HT、SLC22A5和SLC22A4基因mRNA表達量的影響,結果顯示在血乳屏障中ABCG2和ABCB1表達量較高,有可能參與AFM1在血乳屏障中的轉運。同時,我們也采用Western blotting方法檢測了在培養(yǎng)體系中添加AFM1對ABCG2和ABCB1蛋白表達量的影響,結果顯示與不添加AFM1培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞相比,ABCG2和ABCB1蛋白表達量顯著提高(P0.01),這種結果更大程度上表明ABCG2和ABCB1轉運蛋白參與AFM1轉運的可能性。為了進一步研究ABCG2對AFM1轉運作用的影響,試驗構建重組質粒pGCMV-ABCG2-IRES-EGFP對細胞進行瞬時轉染,從而進行ABCG2基因的過表達試驗研究;同時應用RNA干擾的方法用ABCG2 si RNA對細胞進行瞬時轉染,從而進行ABCG2基因的抑制試驗研究。再通過采用熒光定量PCR和Western blotting檢測在培養(yǎng)體系中添加AFM1對體外構建的奶牛血乳屏障中轉運蛋白ABCG2 mRNA和蛋白表達量的影響,同時采用液相色譜法對收集的細胞和Transwell上室的培養(yǎng)液中AFM1的含量進行檢測。熒光定量PCR和Western blotting結果顯示:ABCG2基因的過表達和抑制對ABCG2 mRNA和蛋白表達量均有極顯著性影響(P0.01),而對β-酪蛋白的表達均無顯著性影響(P0.05)。AFM1液相色譜結果顯示:ABCG2基因過表達上調細胞以及上室培養(yǎng)液中AFM1的含量(P0.01),ABCG2基因抑制下調細胞以及上室培養(yǎng)液中AFM1的含量(P0.01)。綜上所述,ABCG2基因參與了AFM1轉運的過程,但未參與奶牛乳腺上皮細胞泌乳和細胞增殖的調節(jié)。對于ABCG2基因參與AFM1轉運機理還需進行深入的研究。
【關鍵詞】：奶牛 血乳屏障 AFM1 轉運蛋白 ABCG2基因
【學位授予單位】：東北農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S823
【目錄】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 前言12-18
• 1.1 黃曲霉毒素的研究進展12-14
• 1.1.1 黃曲霉毒素研究的背景12
• 1.1.2 AFM1及其毒性的研究12-13
• 1.1.3 AFM1穩(wěn)定性的研究13-14
• 1.1.4 牛奶及其他奶制品中AFM1的規(guī)范要求14
• 1.2 血乳屏障的研究進展14-16
• 1.2.1 上皮細胞緊密連接蛋白的研究14
• 1.2.2 乳房炎對血乳屏障影響的研究14-15
• 1.2.3 血乳屏障模型的體外構建研究進展15-16
• 1.3 藥物轉運蛋白的研究概況16-17
• 1.4 研究的目的與意義17-18
• 2 材料與方法18-29
• 2.1 主要的實驗材料、儀器與試劑18
• 2.1.1 實驗材料18
• 2.1.2 實驗儀器18
• 2.1.3 實驗試劑18
• 2.2 實驗方法18-29
• 2.2.1 奶牛乳腺上皮細胞的原代培養(yǎng)18-19
• 2.2.2 奶牛乳腺上皮細胞的鑒定19
• 2.2.3 篩選奶牛乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)的最佳接種密度19-22
• 2.2.4 體外血乳屏障模型的構建22
• 2.2.5 AFM1對乳腺上皮細胞外源性化合物轉運蛋白的影響22-25
• 2.2.6 ABCG2基因過表達對奶牛乳腺上皮細胞的影響25-27
• 2.2.7 ABCG2基因抑制對奶牛乳腺上皮細胞的影響27-28
• 2.2.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析28-29
• 3 結果與分析29-50
• 3.1 奶牛乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)與鑒定29-32
• 3.1.1 奶牛乳腺上皮細胞的純化與鑒定29
• 3.1.2 奶牛乳腺上皮細胞角蛋白18的鑒定29-30
• 3.1.3 奶牛乳腺上皮細胞最佳接種密度的篩選30-31
• 3.1.4 奶牛乳腺上皮細胞生長曲線的測定31-32
• 3.2 奶牛血乳屏障體外的構建與鑒定32-33
• 3.2.1 倒置顯微鏡下觀察奶牛乳腺上皮細胞32
• 3.2.2 掃描電鏡下觀察奶牛乳腺上皮細胞32-33
• 3.2.3 免疫熒光染色檢測緊密連接蛋白ZO-133
• 3.3 AFM1對奶牛乳腺上皮細胞中轉運蛋白表達的影響33-37
• 3.3.1 AFM1的劑量關系33-34
• 3.3.2 AFM1的時間關系34
• 3.3.3 AFM1對ABCB1和ABCG2蛋白表達水平的影響34-35
• 3.3.4 AFM1對β-酪蛋白的蛋白表達水平的影響35-36
• 3.3.5 AFM1對奶牛乳腺上皮細胞細胞增殖的影響36-37
• 3.4 ABCG2基因過表達的實驗結果37-43
• 3.4.1 去內毒素質粒的雙酶切法驗證37-38
• 3.4.2 最佳轉染時間的篩選38
• 3.4.3 ABCG2基因過表達轉染效率的檢測38-39
• 3.4.4 ABCG2基因過表達對奶牛乳腺上皮細胞轉運AFM1的影響39-42
• 3.4.5 ABCG2基因過表達對奶牛乳腺上皮細胞泌乳功能的影響42
• 3.4.6 ABCG2基因過表達對奶牛乳腺上皮細胞增殖作用的影響42-43
• 3.5 ABCG2基因抑制的實驗結果43-50
• 3.5.1 ABCG2 siRNA最佳干擾片段和最佳干擾時間43-44
• 3.5.2 干擾效率的檢測44-45
• 3.5.3 ABCG2基因抑制對奶牛乳腺上皮細胞轉運AFM1的影響45-48
• 3.5.4 ABCG2基因抑制對奶牛乳腺上皮細胞泌乳功能的影響48
• 3.5.5 ABCG2基因抑制對奶牛乳腺上皮細胞增殖作用的影響48-50
• 4 討論50-53
• 4.1 奶牛血乳屏障的建立與鑒定50-51
• 4.2 AFM1對奶牛乳腺上皮細胞中轉運蛋白的影響51
• 4.3 ABCG2基因過表達與抑制對AFM1在奶牛乳腺上皮細胞中轉運的影響51-53
• 5 結論53-54
• 致謝54-55
• 參考文獻55-64
• 附錄64-65
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文65

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本文編號：534410