本文關(guān)鍵詞：不同插入位點表達H5亞型AIV HA基因重組雞痘病毒的構(gòu)建及免疫效力的比較研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：H5亞型禽流感(AI)給我國的養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失,而疫苗免疫是防控該病的重要手段。血凝素(HA)是禽流感病毒(AIV)誘導宿主產(chǎn)生中和抗體最重要的保護性抗原,然而HA基因容易發(fā)生突變,導致近年來我國H5亞型AIV出現(xiàn)多個流行分支,因此開發(fā)免疫效果好的多價H5亞型禽流感疫苗對于有效防控該病具有重要意義。雞痘病毒(FPV)具有多個復制非必需區(qū),是構(gòu)建表達H5亞型不同分支HA基因重組疫苗的理想載體。目前,雖然同一復制非必需區(qū)插入多個HA的重組雞痘疫苗已有報道,但該型疫苗免疫效果的提高仍然有限。我們也可在不同復制非必需區(qū)插入不同的HA基因構(gòu)建多價疫苗,而復制非必需區(qū)的篩選可能是影響重組雞痘疫苗免疫效果的關(guān)鍵。因此,本研究構(gòu)建了復制非必需區(qū)(FPV34)表達HA基因的重組雞痘疫苗,并與其它插入位點(FPV12)的重組雞痘病毒進行了生長特性、HA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達水平以及免疫效力的比較研究,旨在為多價H5亞型禽流感重組雞痘疫苗的研制奠定一定的基礎(chǔ)。1表達H5亞型AIV HA基因重組雞痘病毒的構(gòu)建將PCR擴增的雞痘病毒復制非必需區(qū)片段FPV3和FPV4克隆至pBluescript SK(-)載體,得到載體pSKP3P4;然后將從質(zhì)粒pFG1175-1酶切下來的標記基因表達框P11-LacZ和從質(zhì)粒P12LS酶切下來的啟動子Ps分別克隆至載體pSKP3P4,得到轉(zhuǎn)移載體p34xLs;最后將H5亞型AIVSY株(clade 2.3.4)和W6-7株(clade 7.2)的HA基因分別插入轉(zhuǎn)移載體p34xLS中Ps啟動子下游,獲得轉(zhuǎn)移載體p34xLs-SYHA和p34xLs-W6-7HA。用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染已感染FPV的CEF,利用藍白斑篩選獲得純化的表達HA基因的重組雞痘病毒rFPV34-SYHA和rFPV34-W6-7HA。提取重組病毒的基因組DNA,分別擴增HA基因,證明目的基因成功插入雞痘病毒基因組；免疫熒光試驗表明HA基因能夠在重組雞痘病毒中正確表達。2不同插入位點重組雞痘病毒的生長特性、HA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平的比較重組雞痘病毒rFPV12-SYHA和rFPV34-SYHA分別感染雞胚成纖維細胞(CEF),首先測定各病毒的效價及生長曲線。其次,運用相對熒光定量PCR的方法檢測以上兩株重組病毒HA基因在CEF細胞中的轉(zhuǎn)錄水平。最后,采用ELISA比較重組病毒外源基因的蛋白表達水平。生長曲線的結(jié)果表明兩株重組病毒rFPV12-SYHA和rFPV34-SYHA在生長特性方面類似；相對熒光定量PCR的結(jié)果表明了它們在HA基因轉(zhuǎn)錄水平方面沒有顯著差異；ELISA數(shù)據(jù)則證明了rFPV12-SYHA和rFPV34-SYHA在表達HA蛋白方面沒有顯著差異。3表達H5亞型AIVHA基因重組雞痘病毒免疫效力試驗10日齡SPF雞隨機分組,分別免疫rFPV12-SYHA、rFPV34-SYHA、rFPV34-W6-7HA和wt-FPVLP,劑量為105PFU/只,同時設(shè)H5亞型AI油乳劑滅活苗對照組和PBS對照組,劑量為0.2 mL/只。在免疫后7d、10d、14d、17d和21d分別采集外周血,檢測HI抗體效價。結(jié)果顯示,各重組病毒均能夠誘導產(chǎn)生一定水平的HI抗體,但均顯著低于滅活油苗組(P0.05)。免疫后21 d,分別用相應(yīng)的母本SY株和W6-7株進行攻毒,攻毒劑量均為105EID50,隨后觀察各疫苗對雞的免疫保護效果,采集喉拭子和泄殖腔拭子并測定排毒情況。結(jié)果表明,針對AIVSY株攻擊,rFPV12-SYHA和rFPV34-SYHA免疫組的攻毒保護率為85%,而免疫滅活油苗SY組的保護率為95%；針對AIV W6-7株攻擊,rFPV34-W6-7HA免疫組的保護率為90%,滅活油苗W6-7免疫組的保護率同樣為90%。綜上所述,在不同復制非必需區(qū)(FPV12和FPV34)表達H5亞型AIV HA基因的重組雞痘病毒,其生長特性、基因的轉(zhuǎn)錄水平、蛋白的表達水平和免疫保護效力類似；證明了這兩個復制非必需區(qū)均可作為外源片段的插入?yún)^(qū),這為研制H5 AIV多價疫苗奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：H5亞型禽流感病毒 HA基因 雞痘病毒 復制非必需區(qū) 免疫效力
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-9
• 符號說明9-10
• 綜述10-26
• 參考文獻19-26
• 第一章 表達H5亞型AIV HA基因的重組雞痘病毒的構(gòu)建26-45
• 1 材料26-27
• 2 方法27-38
• 3 結(jié)果38-42
• 4 討論42-43
• 參考文獻43-45
• 第二章 不同插入位點重組雞痘病毒的生長特性、HA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平的比較45-53
• 1 材料45-46
• 2 方法46-48
• 3 結(jié)果48-51
• 4 討論51-52
• 參考文獻52-53
• 第三章 表達H5亞型AIV HA基因重組雞痘病毒的免疫效力試驗53-61
• 1 材料53
• 2 方法53-54
• 3 結(jié)果54-58
• 4 討論58-60
• 參考文獻60-61
• 全文小結(jié)61-62
• 致謝62-63

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 彭蕓蕓;仲曉寧;李春蕾;;偽狂犬病毒載體的研究進展[J];山東畜牧獸醫(yī);2013年05期

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  本文關(guān)鍵詞：不同插入位點表達H5亞型AIV HA基因重組雞痘病毒的構(gòu)建及免疫效力的比較研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：443444