本文關(guān)鍵詞：miR-324-3p對羊駝黑素刺激素受體1基因功能的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：黑素皮質(zhì)素受體1 (melanocortin-1 receptor, MC1R)定位于成熟黑色素細(xì)胞表面,該基因被視為動物黑色素合成及類型轉(zhuǎn)變相關(guān)基因的主效基因之一。經(jīng)預(yù)測篩選,miR-324-3p能靶向調(diào)控MC1R基因的表達(dá)。為了研究niR-324-3p對羊駝MC1R基因功能的影響,本試驗(yàn)通過雙熒光素酶報告載體驗(yàn)證miR-324-3p與靶基因間的靶向關(guān)系,向體外培養(yǎng)的羊駝皮膚黑色素細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-324-3p過表達(dá)載體,應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR、蛋白免疫印跡方法對MCIR及其下游調(diào)控的毛色相關(guān)基因在mRNA及蛋白水平的表達(dá)量進(jìn)行分析,并采用酶標(biāo)儀測定黑色素產(chǎn)量。試驗(yàn)方法及主要研究結(jié)果如下：1 應(yīng)用qRT-PCR分析miR-324-3p在白色與棕色羊駝皮膚黑色素細(xì)胞中的表達(dá)差異性。結(jié)果顯示,miR-324-3p在棕色羊駝皮膚黑色素細(xì)胞中的表達(dá)量極顯著高于在白色的表達(dá)量(P0.01),且在棕色羊駝皮膚黑色素細(xì)胞中的相對表達(dá)量是白色羊駝的1.64倍。2應(yīng)用雙熒光素酶報告基因試驗(yàn)驗(yàn)證miR-324-3p與MC1R基因間的靶向關(guān)系。將體外培養(yǎng)的293T細(xì)胞分為3個組,分別為A組(只轉(zhuǎn)染pmirGLO-MC 1 R-3'UTR載體)、B組(同時轉(zhuǎn)染miR-NC與pmirGLO-MC1R-3'UTR載體)、C組(同時轉(zhuǎn)染pmirGLO-MC1R-3'UTR與miR-324-3p過表達(dá)載體)。結(jié)果顯示,含miR-324-3p過表達(dá)載體組的熒光素酶活性是對照組的0.69倍。3 應(yīng)用qRT-PCR測定MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量。將體外培養(yǎng)的羊駝皮膚黑色素細(xì)胞分為3個組,分別為試驗(yàn)處理組(miR組,轉(zhuǎn)染miR-324-3p過表達(dá)載體)、Negtive Control組(NC組，只轉(zhuǎn)染miR-NC空載體)、空白組(KB組，，不做載體轉(zhuǎn)染)。結(jié)果顯示,(1)miR組MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量分別是NC組的0.194、0.473、0.550及0.920倍，其中MC1R、Mitf及Tyr的表達(dá)量較NC組均差異極顯著(P0.01), Tyrp2的表達(dá)量較NC組差異顯著(P0.05)；(2)miR組MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量分別是KB組的0.019、0.321、0.180及0.347倍,miR組中MC1R、Mitf、Tyr和Tyrp2的表達(dá)量較KB組均差異極顯著(P0.01)。4應(yīng)用Western blotting測定各試驗(yàn)組中MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2基因在蛋白水平的表達(dá)量。結(jié)果顯示,miR組MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2基因在蛋白水平的表達(dá)量分別是NC組的0.815、0.389、0.903、0.808倍,是KB組的0.811、0.382、0.889、0.733倍；miR組中的4個基因在蛋白水平的表達(dá)量較NC與KB組均差異極顯著(P0.01)。5應(yīng)用酶標(biāo)儀分別測定3組黑色素細(xì)胞中黑色素的A475吸光值,用各處理組黑色素的A475吸光值占空白組的比值表示各組黑色素的相對產(chǎn)量。結(jié)果顯示,miR組黑色素相對產(chǎn)量是0.498739±0.0112840,NC組黑色素相對產(chǎn)量是0.878930士0.0202527,KB組黑色素相對產(chǎn)量為1.000000±0.0342576,miR組黑色素相對產(chǎn)量較NC與KB組均差異極顯著(P0.01)。上述結(jié)果證實(shí)羊駝皮膚黑色素細(xì)胞中表達(dá)的miR-324-3p可靶向調(diào)控MC1R基因的表達(dá),進(jìn)而影響MC1R下游調(diào)控的黑色素形成相關(guān)基因的表達(dá),影響黑色素的細(xì)胞合成,為研究]miR-324-3p與MC1R基因與羊駝毛色形成機(jī)制提供理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：羊駝 miR-324-3p MC1R qRT-PCR 黑色素
【學(xué)位授予單位】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S829.9
【目錄】：

• 摘要8-10
• 前言10-11
• 文獻(xiàn)綜述11-20
• 1 miRNA的生物合成及其功能11-14
• 1.1 miRNA的細(xì)胞合成11-12
• 1.2 miRNA與黑色素形成相關(guān)研究12-13
• 1.3 miR-324-3p的研究進(jìn)展13-14
• 2 黑色素合成的相關(guān)基因14-17
• 2.1 MC1R基因14-15
• 2.2 Mitf基因15-16
• 2.3 酪氨酸酶基因家族基因(Tyr、Tyrp1、Tyrp2)16-17
• 3 黑色素的細(xì)胞合成及檢測17-19
• 3.1 黑色素的細(xì)胞合成17-18
• 3.2 體外黑色素含量的檢測18-19
• 4 本研究的研究目的意義19-20
• 材料和方法20-34
• 1 試驗(yàn)材料20-23
• 1.1 試驗(yàn)樣本20
• 1.2 試驗(yàn)所用儀器設(shè)備20
• 1.3 細(xì)胞培養(yǎng)所需主要試劑及耗材20-21
• 1.4 載體構(gòu)建所需主要試劑及耗材21
• 1.5 雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)靶基因驗(yàn)證所需試劑21-22
• 1.6 過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞所需試劑耗材22
• 1.7 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄PCR、qRT-PCR所需試劑及耗材22
• 1.8 蛋白免疫印跡所需試劑及耗材22-23
• 1.9 黑色素含量測定所需試劑及耗材23
• 2 試驗(yàn)方法23-34
• 2.1 羊駝皮膚黑色素細(xì)胞的培養(yǎng)23-24
• 2.1.1 細(xì)胞復(fù)蘇23-24
• 2.1.2 細(xì)胞傳代24
• 2.1.3 細(xì)胞凍存24
• 2.2 羊駝皮膚黑色素細(xì)胞總RNA的提取24
• 2.3 內(nèi)源性miRNA-324-3p的PCR擴(kuò)增及表達(dá)差異性驗(yàn)證24-26
• 2.3.1 總RNA反轉(zhuǎn)錄PCR24-25
• 2.3.2 內(nèi)源性miRNA-324-3p的PCR擴(kuò)增25-26
• 2.3.3 miR-324-3p在不同毛色羊駝皮膚中的表達(dá)差異性26
• 2.4 miR-324-3p過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染羊駝皮膚黑色素細(xì)胞26-27
• 2.5 雙熒光素酶報告基因靶基因驗(yàn)證27-29
• 2.5.1 pMD18T-MC1R-3'UTR Plasmid構(gòu)建27-28
• 2.5.2 pmirGLO-MC1R-3'UTR Plasmid構(gòu)建28-29
• 2.6 qRT-PCR檢測不同試驗(yàn)組中MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2的表達(dá)差異性29-30
• 2.7 Weatern Blotting30-32
• 2.7.1 黑色素細(xì)胞總蛋白提取30-31
• 2.7.2 各目的蛋白及內(nèi)參蛋白Western Blotting31-32
• 2.8 黑色素提取及含量測定32-34
• 試驗(yàn)結(jié)果34-46
• 3.1 羊駝miR-324-3p及其靶基因的預(yù)測34
• 3.1.1 羊駝miR-324-3p成熟體34
• 3.1.2 羊駝miR-324-3p靶基因的預(yù)測34
• 3.2 羊駝皮膚黑色素細(xì)胞總RNA的提取34-35
• 3.3 內(nèi)源性miRNA-324-3p的PCR擴(kuò)增及表達(dá)差異性檢測35-37
• 3.3.1 不同毛色羊駝黑色素細(xì)胞中miRNA-324-3p的擴(kuò)增35-36
• 3.3.2 miR-324-3p在不同毛色羊駝黑色素細(xì)胞中的表達(dá)差異性36
• 3.3.3 轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體后羊駝黑色素細(xì)胞中miR-324-3p的表達(dá)差異性36-37
• 3.4 構(gòu)建的pmirGLO-MC1R-3'UTR載體圖譜及其測序結(jié)果37-38
• 3.4.1 pmirGLO-MC1R-3'UTR載體測序結(jié)果37
• 3.4.2 pPG/miR/eGFP/Blasticidin-miR-324-3p測序結(jié)果及其載體圖譜37-38
• 3.5 雙熒光素酶報告基因靶基因驗(yàn)證38-39
• 3.6 qRT-PCR分析MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2基因的表達(dá)39-42
• 3.6.1 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染羊駝皮膚黑色素細(xì)胞效率鑒定39-40
• 3.6.2 MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2基因qRT-PCR擴(kuò)增曲線40-41
• 3.6.3 miR-324-3p對MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2基因表達(dá)的影響41-42
• 3.7 蛋白免疫印跡分析MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2蛋白水平表達(dá)差異42-45
• 3.7.1 羊駝皮膚黑色素細(xì)胞總蛋白條帶42-43
• 3.7.2 miR-324-3p對試驗(yàn)組中各目的基因在蛋白水平表達(dá)差異性的影響43-45
• 3.8 miR-324-3p對黑色素產(chǎn)量的影響45-46
• 討論46-49
• 4.1 miR-324-3p與黑色素合成46-47
• 4.2 miR-324-3p對MC1R基因的影響47-49
• 4.3 展望49
• 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-56
• Abstract56-58
• 致謝58

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