本文關(guān)鍵詞：MBV、SRV、SIV血清抗體調(diào)查及間接ELISA檢測方法的初步建立，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：猴B病毒(Monkey B virus, MBV)是普通級實(shí)驗(yàn)猴的必須檢測項(xiàng)目,要求陰性,可感染多種動(dòng)物和人,人感染后的死亡率高達(dá)80%,幸存者有神經(jīng)后遺癥,而猴感染后僅表現(xiàn)輕微的皰疹癥狀或無癥狀,但長期帶毒、間歇排毒,其潛伏感染的特性常造成假陰性檢測結(jié)果。MBV只有一個(gè)血清型,抗原性穩(wěn)定,其核苷酸序列和氨基酸序列己確定,囊膜糖蛋白gD被證實(shí)有較高的診斷潛能。猴D型逆轉(zhuǎn)錄病毒(Simian type D Retrovirus, SRV)、猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus, SIV)是SPF級實(shí)驗(yàn)猴的必需檢測項(xiàng)目,要求陰性。SRV和SIV是猴艾滋病的病原,感染后都會(huì)引起免疫缺陷癥狀,但是SIV在其天然宿主不致病,只有跨種群感染才會(huì)導(dǎo)致猴艾滋病的發(fā)生。SRV有7個(gè)血清型,其中1～3己測序完成,核衣殼蛋白p27的氨基酸序列高度保守。SIV衣殼蛋白p27含有主要抗原決定簇,且具有群抗原性,被認(rèn)為是SIV抗原檢測的標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)主要從以下三方面開展：1.上海地區(qū)實(shí)驗(yàn)用猴MBV、SRV、SIV三種病毒的血清抗體調(diào)查共檢測475份血清樣本,MBV血清抗體陽性34份,陽性率7.158%；SRV血清抗體陽性20份,陽性率4.211%; SIV血清抗體陽性1份,陽性率0.2105%,陽性率與年份和樣本總數(shù)沒有相關(guān)性。2.目的蛋白的表達(dá)、純化及鑒定將pET28a-gD (MBV)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)菌株,表達(dá)MBV gD蛋白,分子量約為48.24kD,經(jīng)鎳瓊脂糖親和層析純化后,用Western blot證明該蛋白具有抗原性,測得蛋白濃度為3.726mg/mL。將pET28b-p27 (SRV)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到tosetta (DE3)菌株,表達(dá)SRV p27蛋白,分子量約為26.2kD,經(jīng)鎳瓊脂糖親和層析純化后,用Western blot證明該蛋白具有抗原性,測定蛋白濃度為2.043mg/mL。將pET28a-p27 (SIV)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Rosetta (DE3)菌株,表達(dá)SIV p27蛋白,分子量約為24.6kD,經(jīng)鎳瓊脂糖親和層析純化后,用Western blot證明該蛋白具有抗原性,測定蛋白濃度為1.604mg/mL3.間接ELISA方法的建立及評價(jià)用4BV gD蛋白作為抗原,建立檢測MBV血清抗體的間接ELISA方法,確定的最佳反應(yīng)條件為：抗原1：1280稀釋(濃度為2.913μg/孔)；血清1：100稀釋,作用60min；酶標(biāo)抗體1：20000稀釋,作用60min,底物顯色15min。OD值≥0.326判為陽性,OD值≤0.255判為陰性。實(shí)驗(yàn)證明gD蛋白不與SRV.SIV發(fā)生交叉反應(yīng),所建立的方法與全病毒試劑盒檢測結(jié)果的符合率為96.74%,批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)中陰、陽對照的OD值變異系數(shù)小于14%。應(yīng)用該方法檢測2016年上海地區(qū)送檢的37份猴血清,檢出陽性1份,陽性率為2.703%。用SRVp27蛋白作為抗原,建立檢測SRV血清抗體的間接ELISA方法,確定的最佳反應(yīng)條件為：抗原1：640稀釋(濃度為3.193μg/孔)；血清1：100稀釋,作用6Omin；酶標(biāo)抗體1：20000稀釋,作用60min,底物顯色15min。OD值≥0.297判為陽性,OD值_0.244判為陰性。實(shí)驗(yàn)證明p27蛋白不與MBV.SIV發(fā)生交叉反應(yīng),所建立的方法與全病毒試劑盒檢測結(jié)果的符合率為97.87%,批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)中陰、陽對照的OD值變異系數(shù)小于9%。應(yīng)用該方法檢測2016年上海地區(qū)送檢的37份猴血清,檢出陽性2份,陽性率為5.405%。用SIV p27蛋白作為抗原,建立檢測SIV血清抗體的間接ELISA方法,確定的最佳反應(yīng)條件為：抗原1：640稀釋(濃度為2.508μg/孔)；血清1：100稀釋,作用60min;酶標(biāo)抗體1：10000稀釋,作用60min,底物顯色15min。OD值≥0.269判為陽性,OD值≤0.256判為陰性。實(shí)驗(yàn)證明p27蛋白不與MBV、SRV發(fā)生交叉反應(yīng),所建立的方法與全病毒試劑盒檢測結(jié)果的符合率為98.91%,批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)中陰、陽對照的OD值變異系數(shù)小于3%。應(yīng)用該方法檢測2016年上海地區(qū)送檢的37份猴血清,檢出陽性0份,陽性率為0。
【關(guān)鍵詞】：猴B病毒 猴D型逆轉(zhuǎn)錄病毒 猴免疫缺陷病毒 間接ELISA
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-10
• 第1章 文獻(xiàn)綜述10-22
• 1. MBV研究進(jìn)展10-15
• 1.1 MBV的溯源及命名10
• 1.2 MBV的生物學(xué)特征10-12
• 1.3 MBV的感染狀況12-13
• 1.4 MBV的檢測方法13-15
• 1.5 MBV的預(yù)防及治療15
• 2. SRV研究進(jìn)展15-18
• 2.1 SRV的溯源15-16
• 2.2 SRV的基因組特征16
• 2.3 SRV的血清型16-17
• 2.4 SRV的感染及傳播17
• 2.5 SRV的診斷17
• 2.6 SRV的治療和預(yù)防17-18
• 3. SIV研究進(jìn)展18-20
• 3.1 SIV的分子生物學(xué)特性18
• 3.2 SIV的致病性18-19
• 3.3 SAIDS動(dòng)物模型的可行性及實(shí)用意義19
• 3.4 SIV的檢測19-20
• 4. 結(jié)語20-22
• 第2章 上海地區(qū)實(shí)驗(yàn)用猴MBV、SRV、SIV三種病毒的血清抗體調(diào)查22-25
• 1. 主要材料22
• 2. 主要儀器22
• 3. 檢測結(jié)果22-23
• 3.1 MBV血清抗體檢測結(jié)果22
• 3.2 SRV血清抗體檢測結(jié)果22-23
• 3.3 SIV血清抗體檢測結(jié)果23
• 4. 討論23-25
• 第3章 目的蛋白的表達(dá)、純化及鑒定25-36
• 1. 菌株25
• 2. 主要試劑25
• 3. 主要儀器25
• 4. 實(shí)驗(yàn)方法25-27
• 4.1 轉(zhuǎn)化25
• 4.2 小試培養(yǎng)選擇最佳的誘導(dǎo)條件25-26
• 4.3 大量誘導(dǎo)26
• 4.4 超聲破碎菌體26
• 4.5 鎳瓊脂糖親和層析26
• 4.6 SDS-PAGE檢測26
• 4.7 Western blot檢測26-27
• 4.8 測定目的蛋白濃度27
• 5. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-35
• 5.1 MBV gD蛋白表達(dá)及檢測結(jié)果27-29
• 5.2 SRV重組蛋白表達(dá)及檢測結(jié)果29-32
• 5.3 SIV重組蛋白表達(dá)及檢測結(jié)果32-35
• 6. 討論35-36
• 第4章 檢測MBV、SRV、SIV血清抗體的間接ELISA方法的初步建立36-56
• 1. 主要材料及試劑36
• 2. 主要儀器設(shè)備36
• 3. 間接ELISA操作程序36
• 4. 間接ELISA方法的初步建立36-38
• 4.1 工作條件摸索試驗(yàn)36-37
• 4.1.1 抗原最適包被量與血清最適稀釋度的確定試驗(yàn)36
• 4.1.2 酶標(biāo)抗體最適工作濃度確定試驗(yàn)36-37
• 4.2 工作條件的優(yōu)化37
• 4.2.1 最適包被條件的確定試驗(yàn)37
• 4.2.2 血清最適作用時(shí)間的確定試驗(yàn)37
• 4.2.3 酶標(biāo)抗體最適作用時(shí)間的確定試驗(yàn)37
• 4.2.4 最適封閉液確定試驗(yàn)37
• 4.2.5 底物最適顯色時(shí)間確定試驗(yàn)37
• 4.3 判定標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)37
• 4.4 方法性能評價(jià)37-38
• 4.4.1 交叉反應(yīng)試驗(yàn)37
• 4.4.2 競爭性抑制試驗(yàn)37-38
• 4.4.3 敏感性試驗(yàn)(最低抗體檢出效價(jià)試驗(yàn))38
• 4.4.4 批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)38
• 4.4.5 與全病毒ELISA檢測試劑盒檢測結(jié)果比較試驗(yàn)38
• 4.4.6 反應(yīng)系統(tǒng)保存試驗(yàn)38
• 4.5 間接ELISA方法的應(yīng)用38
• 5. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-53
• 5.1 檢測MBV血清抗體的間接ELISA方法的初步建立38-43
• 5.2 檢測SRV血清抗體的間接ELISA方法的建立43-48
• 5.3 檢測SIV血清抗體的間接ELISA方法的建立48-53
• 6. 討論53-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-62
• 附錄62-63
• 致謝63-64
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文64-65

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 葉華虎;袁菊芳;劉歡;范玉筠;;猴B病毒囊膜蛋白gD的B細(xì)胞表位預(yù)測及鑒定[J];中國比較醫(yī)學(xué)雜志;2014年11期

2 張金陽;孫濤;楊光文;宋玉竹;韓芹芹;夏雪山;;猴B病毒gG蛋白的主要特性與B細(xì)胞表位預(yù)測[J];昆明理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2014年02期

3 熊煒;蔣靜;張強(qiáng);盤寶進(jìn);李健;魏曉鋒;黃忠榮;胡建華;;猴逆轉(zhuǎn)錄病毒RT-PCR和Real-time RT-PCR檢測方法的建立[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2013年12期

4 王靜;張

本文編號：444098