本文關(guān)鍵詞：豬源趨化因子CXCL17的基因克隆與刺激表達(dá)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：CXC趨化因子家族配基17(CXC Ligand 17,CXCL17)是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的趨化因子,僅有10年歷史,目前主要關(guān)于人源和鼠源CXCL17的研究,豬源CXCL17相關(guān)研究尚未見報(bào)道。已有人源和鼠源CXCL17研究報(bào)道,它是一個(gè)多功能蛋白質(zhì),具有潛在的殺菌活性,抗炎活性,促進(jìn)血管生成及抗凋亡活性。這些活性研究主要集中于單核-巨噬細(xì)胞及各種腫瘤細(xì)胞等,未涉及到腸道細(xì)胞。腸道的健康水平很大程度的影響了豬的養(yǎng)殖,豬源CXCL17基因的克隆及其在豬腸道中的表達(dá)研究,不僅為人們對(duì)CXCL17帶來(lái)更全面的認(rèn)識(shí),也將會(huì)為一些豬腸道疾病的研究帶來(lái)更新的了解,甚至給出更好的治療解決方案。本研究以人CXCL17基因核苷酸序列為模板,從豬的EST庫(kù)中篩選出一系列相似序列,利用軟件拼接后,預(yù)測(cè)到豬CXCL17基因序列,以豬肺組織總RNA經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后的c DNA為模板再次擴(kuò)增,得到了豬CXCL17基因序列。對(duì)所得豬CXCL17核苷酸序列及氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,預(yù)測(cè)豬CXCL17是一個(gè)親水性小分子堿蛋白。另外,通過(guò)信號(hào)肽分析,預(yù)測(cè)其也是一個(gè)分泌性蛋白。此外,同源性及進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示它與人CXCL17具有較高的相似度及親緣性,因此,豬CXCL17在功能上應(yīng)與人CXCL17極為接近。同時(shí)做組織分布研究,確定了豬CXCL17的結(jié)構(gòu)特性和分布特點(diǎn),發(fā)現(xiàn)它在肺,胃部以及小腸中的分泌居多。接著構(gòu)建了豬CXCL17的原核表達(dá)載體p ET28a-sus CXCL17,以及真核表達(dá)載體pc DNA-sus CXCL17,用于后續(xù)對(duì)豬CXCL17蛋白結(jié)構(gòu)和活性更深入的探索。另外本研究,對(duì)豬CXCL17在腸道細(xì)胞中的表達(dá)做了研究。用多種細(xì)菌感染IPEC-J2細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)IPEC-J2細(xì)胞受大腸桿菌等革蘭氏陰性菌刺激時(shí)CXCL17的表達(dá)水平增高顯著,初步證實(shí)腸道受到革蘭氏陰性菌的感染時(shí)高表達(dá)CXCL17,進(jìn)而發(fā)揮著抗菌作用,此外推測(cè)革蘭氏陰性菌區(qū)別于革蘭氏陽(yáng)性菌的特有成分——脂多糖對(duì)于CXCL17的誘導(dǎo)發(fā)揮著主要作用。接著提取了大腸桿菌的脂多糖成分,以不同劑量分別作用于IPEC-J2細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)脂多糖作用時(shí),CXCL17的表達(dá)升高,而且與脂多糖存在劑量依賴關(guān)系。以上實(shí)驗(yàn)證明脂多糖能夠激活腸道細(xì)胞中CXCL17的高表達(dá),推測(cè)CXCL17在豬腸道中對(duì)于革蘭氏陰性菌的感染以及脂多糖引起的腸道炎癥中發(fā)揮抗菌及抗炎作用。
【關(guān)鍵詞】：豬 CXCL17 載體構(gòu)建 細(xì)菌感染
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S828
【目錄】：

• 摘要3-4
• abstract4-6
• 主要英文縮略詞及符號(hào)6-11
• 1 前言11-20
• 1.1 趨化因子的概述11-12
• 1.2 新型趨化因子CXCL17概述12-16
• 1.2.1 人和小鼠CXCL17的發(fā)現(xiàn)12-13
• 1.2.2 CXCL17的特性13-14
• 1.2.3 CXCL17受體的發(fā)現(xiàn)14
• 1.2.4 CXCL17功能作用14-15
• 1.2.5 豬源CXCL17的研究現(xiàn)狀及意義15-16
• 1.3 IPEC-J2細(xì)胞概述16-17
• 1.4 本研究的目的意義與技術(shù)路線17-20
• 2 材料與方法20-37
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料20-24
• 2.1.1 質(zhì)粒20
• 2.1.2 菌株20
• 2.1.3 細(xì)胞20
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織20
• 2.1.5 引物20-21
• 2.1.6 主要試劑與配方21-23
• 2.1.7 主要儀器設(shè)備23-24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法24-37
• 2.2.1 感受態(tài)細(xì)胞的制備24
• 2.2.2 質(zhì)粒的抽提24-25
• 2.2.3 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)25-26
• 2.2.4 Trizol法提取總RNA26-27
• 2.2.5 c DNA第一鏈的合成27
• 2.2.6 基因的克隆與生物信息學(xué)分析27-31
• 2.2.7 原核表達(dá)載體構(gòu)建31-32
• 2.2.8 真核表達(dá)載體構(gòu)建32-33
• 2.2.9 IPEC-J2細(xì)胞的培養(yǎng)33-34
• 2.2.10 轉(zhuǎn)染34
• 2.2.11 細(xì)菌感染IPEC-J2細(xì)胞34-35
• 2.2.12 大腸桿菌脂多糖（LPS）提取35
• 2.2.13 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-q PCR)檢測(cè)基因的表達(dá)35-37
• 3 結(jié)果與分析37-58
• 3.1 豬CXCL17基因的克隆37-40
• 3.1.1 RNA質(zhì)量的檢測(cè)37
• 3.1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成37-38
• 3.1.3 豬CXCL17基因的擴(kuò)增38-39
• 3.1.4 豬CXCL17基因T載體構(gòu)建39-40
• 3.2 生物信息學(xué)分析40-48
• 3.2.1 豬CXCL17基因開放閱讀框(ORF)尋找及組成分析40-41
• 3.2.2 豬CXCL17蛋白理化性質(zhì)分析41-42
• 3.2.3 豬CXCL17蛋白的親水性、疏水性分析42-43
• 3.2.4 豬CXCL17信號(hào)肽序列預(yù)測(cè)分析43-44
• 3.2.5 豬CXCL17蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析44-45
• 3.2.6 豬CXCL17二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析45-46
• 3.2.7 豬CXCL17蛋白質(zhì)氨基酸序列同源性分析46
• 3.2.8 豬CXCL17氨基酸序列進(jìn)化樹構(gòu)建與分析46-48
• 3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-q PCR)檢測(cè)豬CXCL17表達(dá)方法的構(gòu)建48-50
• 3.3.1 RT-q PCR的引物特異性鑒定48-49
• 3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立49-50
• 3.4 豬CXCL17的組織分布50-51
• 3.5 豬CXCL17的原核表達(dá)51-53
• 3.5.1 帶酶切位點(diǎn)引物的設(shè)計(jì)與合成51
• 3.5.2 豬CXCL17成熟肽基因的擴(kuò)增51-52
• 3.5.3 重組原核表達(dá)質(zhì)粒鑒定52-53
• 3.5.4 重組原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)53
• 3.6 豬CXCL17真核表達(dá)53-55
• 3.6.1 帶酶切位點(diǎn)引物的設(shè)計(jì)與合成53
• 3.6.2 豬CXCL17全長(zhǎng)肽基因的擴(kuò)增53-54
• 3.6.3 重組真核表達(dá)質(zhì)粒鑒定54
• 3.6.4 重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染IPEC-J2細(xì)胞CXCL17的表達(dá)54-55
• 3.7 不同細(xì)菌感染IPCE-J2細(xì)胞后CXCL17的表達(dá)55-56
• 3.8 不同劑量LPS作用IPEC-J2細(xì)胞后CXCL17的表達(dá)56-58
• 4 討論與結(jié)論58-61
• 4.1 討論58-60
• 4.2 結(jié)論60-61
• 致謝61-62
• 參考文獻(xiàn)62-66

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

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  本文關(guān)鍵詞：豬源趨化因子CXCL17的基因克隆與刺激表達(dá)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：441873