本文關(guān)鍵詞：H9N2AIV對肉雞腸道菌群和腸道組織緊密連接的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：H9N2亞型禽流感病毒(H9N2 AIV)是一種低致病性禽流感病毒,其臨床癥狀表現(xiàn)溫和,易繼發(fā)細菌感染和支原體感染,對我國畜牧業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。H9N2AIV感染肉雞引起機體免疫抑制,繼發(fā)感染細菌時常伴發(fā)胃腸道炎癥,但H9N2 AIV感染后對肉雞腸道菌群的影響仍未可知。本研究通過Illumina Hiseq 2000測序技術(shù)和實時熒光定量PCR(qPCR)的方法研究H9N2 AIV感染后肉雞腸道菌群結(jié)構(gòu)及其腸道粘膜組織緊密連接的變化,為H9N2 AIV繼發(fā)感染的防控提供理論指導(dǎo),為進一步研發(fā)抗流感病毒的微生態(tài)制劑提供理論依據(jù)。本研究對1株于2015年1月在河南某雞場分離到的H9N2 AIV(毒株HN/SH01/15)進行純化,并測定分離株的毒價為106.13 EID50/0.1mL;通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明該分離株屬于H9.4.2.1亞分支,其與國內(nèi)疫苗毒株SH/F/98株之間的同源性達到89.4%,與GD/SS/94株之間的同源性是90.4%,與SD/6/96株之間的同源性是89.8%。本研究利用Illumina Hiseq 2000測序平臺對感染SH01毒株的雞的回腸粘膜和盲腸粘膜菌群基因組DNA進行16S rDNA宏基因組測序,以分析H9N2 AIV對肉雞腸道菌群的影響。測序結(jié)果表明:1)回腸菌群序列深度基本覆蓋樣品中所有的物種,滿足試驗分析需要;2)攻毒組均含特異Operational Taxonomic Unit(OTU);3)感染H9N2 AIV后肉雞腸道菌群組成和各菌屬相對豐度發(fā)生了變化,且盲腸粘膜上缺少考拉桿菌屬,出現(xiàn)Sutterella。本研究用qPCR方法對感染H9N2 AIV后肉雞回腸和盲腸粘膜埃希氏菌屬含菌量進行檢測,進一步驗證16S rDNA宏基因組測序的結(jié)果。結(jié)果表明,與空白組相比,攻毒后第5天攻毒組埃希氏菌屬在回腸粘膜上增加(p0.05),在盲腸粘膜上增加;攻毒后第12天埃希氏菌屬在回腸粘膜上減少(p0.01),在盲腸粘膜上減少。其變化的趨勢與Illumina宏基因組測序結(jié)果一致。本研究用相對熒光定量PCR對感染H9N2 AIV后肉雞回腸和盲腸粘膜緊密連接進行探究。結(jié)果表明:攻毒后第5天,回腸絨毛長度顯著降低(p0.05);盲腸粘膜結(jié)構(gòu)蛋白ZO-1和Occludin極顯著下調(diào)(p0.01)。攻毒后第12天,回腸隱窩顯著降低(p0.05),絨毛長度/隱窩深度顯著減少(p0.05),Occludin mRNA表達量顯著下調(diào)(p0.05);盲腸粘膜上Occludin mRNA表達量下調(diào)極顯著(p0.01)。H9N2 AIV感染雞后,降低了粘膜組織緊密連接,能夠增加腸道粘膜組織通透性。本研究表明H9N2 AIV感染能夠造成腸道菌群紊亂,感染后腸道粘膜組織緊密連接降低,增加了宿主繼發(fā)感染的機會。
【關(guān)鍵詞】：H9N2 AIV 腸道菌群 Illumina Hiseq 2000測序平臺 qPCR 緊密連接
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.31
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 中英文縮略表7-11
• 1 前言11-18
• 1.1 禽流感病毒簡介11-12
• 1.1.1 禽流感病毒的結(jié)構(gòu)與分類11
• 1.1.2 H9N2 AIV的共感染11-12
• 1.2 腸道微生物菌群的研究12-17
• 1.2.1 腸道微生物菌群與宿主健康息息相關(guān)。12-14
• 1.2.1.1 腸道微生物與宿主的腸道生理結(jié)構(gòu)和功能12-13
• 1.2.1.2 腸道微生物與宿主的物質(zhì)代謝13
• 1.2.1.3 腸道微生物與宿主免疫調(diào)節(jié)13-14
• 1.2.1.4 腸道微生物與宿主的異物代謝14
• 1.2.2 腸道微生物菌群與宿主疾病的研究14-16
• 1.2.2.1 腸道微生物與全身代謝疾病14-15
• 1.2.2.2 腸道微生物與腸易激綜合征15-16
• 1.2.3 宏基因組高通量測序的研究與應(yīng)用16-17
• 1.3 研究目的和意義17-18
• 2 試驗材料與方法18-27
• 2.1 試驗材料18-21
• 2.1.1 毒株18
• 2.1.2 SPF雞胚和SPF雞18
• 2.1.3 引物18-20
• 2.1.3.1 測序引物18-19
• 2.1.3.2 熒光定量引物19-20
• 2.1.4 菌種與質(zhì)粒20
• 2.1.5 標(biāo)準陽性血清與抗原20
• 2.1.6 主要試劑及配制20-21
• 2.1.7 酶及其他試劑、試劑盒21
• 2.1.8 主要儀器設(shè)備21
• 2.2 方法21-27
• 2.2.1 H9N2 AIV的純化與HA基因序列分析21-24
• 2.2.1.1 病毒的純化及保存21-22
• 2.2.1.2 病毒EID50的測定22
• 2.2.1.3 H9N2 AIV HA基因的克隆、測序及分析22-24
• 2.2.2 動物實驗24-25
• 2.2.2.1 動物飼養(yǎng)、攻毒24
• 2.2.2.2 樣品采集24-25
• 2.2.2.3 排毒檢測25
• 2.2.2.4 樣品處理25
• 2.2.3 Illumina宏基因組測序25-26
• 2.2.4 絕對熒光定量PCR26-27
• 2.2.4.1 標(biāo)準質(zhì)粒的構(gòu)建26
• 2.2.4.2 標(biāo)準曲線的構(gòu)建26-27
• 2.2.4.3 絕對熒光定量PCR反應(yīng)27
• 2.2.5 相對熒光定量PCR27
• 2.2.6 數(shù)據(jù)分析27
• 3 結(jié)果與分析27-50
• 3.1 H9N2 AIV病毒毒價的測定與HA基因序列分析27-30
• 3.1.1 H9N2 AIV病毒毒價的測定結(jié)果27
• 3.1.2 HA基因遺傳進化分析27-28
• 3.1.3 HA基因同源性分析28-30
• 3.2 排毒檢測30
• 3.3 H9N2 AIV對肉雞腸道菌群影響的宏基因組測序分析30-47
• 3.3.1 回腸粘膜菌群序列樣品深度分析30
• 3.3.2 回腸粘膜菌群OTU Venn圖的分析30-32
• 3.3.3 回腸粘膜菌群物種及其豐度分析32-39
• 3.3.3.1 回腸粘膜菌群物種多樣性指數(shù)分析32-33
• 3.3.3.2 回腸粘膜菌群物種結(jié)構(gòu)組成變化分析33-37
• 3.3.3.3 H9N2 AIV對雞回腸粘膜菌群結(jié)構(gòu)的影響37-39
• 3.3.4 盲腸粘膜中菌群OTU及其豐度分析39-41
• 3.3.4.1 盲腸粘膜菌群序列樣品深度分析39
• 3.3.4.2 盲腸粘膜菌群OTU Venn圖的分析39-41
• 3.3.5 盲腸粘膜菌群物種及其豐度分析41-47
• 3.3.5.1 盲腸粘膜菌群物種多樣性指數(shù)分析41-42
• 3.3.5.2 盲腸粘膜群落結(jié)構(gòu)變化42-45
• 3.3.5.3 H9N2 AIV對雞盲腸粘膜菌群物種結(jié)構(gòu)的影響45-47
• 3.4 qPCR檢測腸道內(nèi)埃希氏菌屬的變化47-48
• 3.5 H9N2 AIV對肉雞腸道緊密連接的影響48-50
• 3.5.1 回腸形態(tài)結(jié)構(gòu)HE染色結(jié)果48-49
• 3.5.2 腸道粘膜結(jié)構(gòu)蛋白mRNA的表達量變化49-50
• 4 討論50-56
• 4.1 H9N2 AIV流行情況50-51
• 4.2 感染H9N2 AIV的肉雞腸道菌群的宏基因組測序分析51-54
• 4.3 H9N2 AIV對肉雞腸道緊密連接功能的影響54-55
• 4.4 結(jié)論55-56
• 致謝56-57
• 參考文獻57-64

【參考文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：H9N2AIV對肉雞腸道菌群和腸道組織緊密連接的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：432024