發(fā)布時(shí)間：2017-06-08 05:12

  本文關(guān)鍵詞：江蘇某豬場(chǎng)2015-2016年豬流行性腹瀉病毒分子流行病學(xué)調(diào)查及基于S蛋白的抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV)引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病,是目前世界范圍內(nèi)豬場(chǎng)多發(fā)的豬病之一。自2010年10月以來(lái),豬流行性腹瀉病的流行強(qiáng)度和流行區(qū)域在不斷地加強(qiáng)和擴(kuò)大,尤其對(duì)哺乳仔豬致死率較高,可高達(dá)100%。在很多接種過(guò)PED疫苗的豬場(chǎng),本病發(fā)病率及仔豬死亡率仍居高不下,并出現(xiàn)與其他病原混合感染的現(xiàn)象,大大增強(qiáng)了該病的防控難度,也給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此,對(duì)PED的診斷及其抗體監(jiān)測(cè)具有重要意義。雖然目前,已有多種PED的診斷和抗體監(jiān)測(cè)技術(shù),如全病毒包被的ELISA、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)等。但全病毒包被ELISA存在大量制備抗原困難、有散毒危險(xiǎn)等缺點(diǎn)。IFA則需要昂貴的特殊設(shè)備,不適用于臨床檢測(cè)。利用蛋白表達(dá)分子生物學(xué)技術(shù)建立間接ELISA方法成為檢測(cè)PEDV抗體新的方向。本研究從江蘇某豬場(chǎng)進(jìn)行間斷性采樣方法以對(duì)豬流行性腹瀉病毒進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查,利用表達(dá)純化的S蛋白建立了檢測(cè)其抗體的間接ELISA檢測(cè)方法,可進(jìn)一步了解江蘇某豬場(chǎng)PED的流行特點(diǎn),評(píng)價(jià)豬群感染或免疫抗體,為豬群PED疫苗選擇及免疫疫苗后的抗體檢測(cè)提供理論指導(dǎo)及檢測(cè)手段。1.江蘇某豬場(chǎng)PEDV分子流行病學(xué)調(diào)查為了解江蘇某豬場(chǎng)PEDV的流行情況,應(yīng)用RT-PCR方法對(duì)2015年3月至2016年3月間從江蘇某豬場(chǎng)采集的106份疑似豬流行性腹瀉樣品進(jìn)行PEDV檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果顯示PEDV陽(yáng)性率為30.19%(32/106),豬場(chǎng)內(nèi)各年齡段的豬均有出現(xiàn)PEDV感染的現(xiàn)象。設(shè)計(jì)了針對(duì)M、N和ORF3基因的特異性引物,對(duì)其中2個(gè)陽(yáng)性樣品進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增,并將擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與國(guó)內(nèi)外相應(yīng)的基因序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù),發(fā)現(xiàn)目前分離PEDV參考株主要分為G1、G2兩大支,而該豬場(chǎng)的流行毒株位于G1支上,基于ORF3基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)分析可推測(cè),豬場(chǎng)流行毒為PEDV野毒,與國(guó)內(nèi)流行毒相近。2. PEDV部分S基因的原核表達(dá)PEDV的S蛋白在免疫介導(dǎo)中起著重要作用,因此本研究對(duì)豬場(chǎng)流行毒株的部分S基因(編碼蛋白可產(chǎn)生中和抗體,標(biāo)記為Sp)進(jìn)行擴(kuò)增,長(zhǎng)度為711 bp,進(jìn)一步克隆至pET-32a,構(gòu)建了pET-Sp原核表達(dá)質(zhì)粒。重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞后,在28℃、200 rpm條件下,經(jīng)0.2 mM濃度的IPTG誘導(dǎo)獲得可溶性重組S蛋白。Western-blot試驗(yàn)證明表達(dá)的重組蛋白可與PEDV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng),說(shuō)明該重組蛋白有較好的抗原性。3. PEDV抗體間接ELISA檢測(cè)方法的初步建立為監(jiān)測(cè)豬場(chǎng)豬群PEDV抗體水平,初步建立了檢測(cè)PEDV抗體的間接ELISA方法。純化的S蛋白作為包被抗原,最優(yōu)的包被濃度為0.5 μg/ml,4℃包被過(guò)夜,10%的小牛血清37℃封閉2 h,最優(yōu)的待檢血清稀釋度為1：200,37℃作用1 h, HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG 1：8000稀釋,37℃作用1 h,加入TMB顯色液10 min后終止反應(yīng)。當(dāng)待檢血清OD450≥0.273時(shí)判為陽(yáng)性,待檢血清OD4500.273時(shí)判為陰性。用建立的間接ELISA方法對(duì)商品化試劑盒中PRRSV、CSFV、PRV、PCV、FMDV等常見(jiàn)豬病的抗體陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)均呈陰性,說(shuō)明該方法具有良好的特異性。分別用不同批次純化的蛋白及同一批次純化蛋白包被的酶標(biāo)板對(duì)血清樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明該方法具有較好的重復(fù)性。用建立的間接ELISA方法對(duì)臨床47份豬血清進(jìn)行檢測(cè),陽(yáng)性率為72.34%,與進(jìn)口某公司PEDV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒結(jié)果進(jìn)行比較,其符合率為95.74%。說(shuō)明該方法適用于臨床豬群PEDV抗體水平檢測(cè),同時(shí)也為以后診斷試劑盒的研制奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：豬流行性腹瀉病毒 分子流行病學(xué)調(diào)查 S蛋白 原核表達(dá) 間接ELISA檢測(cè)
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.28
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 符號(hào)說(shuō)明8-9
• 文獻(xiàn)綜述9-22
• 參考文獻(xiàn)18-22
• 第一章 江蘇某豬場(chǎng)PEDV分子流行病學(xué)調(diào)查22-36
• 1 材料22-23
• 2 方法23-28
• 3 結(jié)果28-33
• 4 討論33-35
• 參考文獻(xiàn)35-36
• 第二章 豬流行性腹瀉病毒部分S基因的原核表達(dá)36-53
• 1 材料36-38
• 2 方法38-44
• 3 結(jié)果44-50
• 4 討論50-52
• 參考文獻(xiàn)52-53
• 第三章 PEDV抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立53-67
• 1 材料53-55
• 2 方法55-58
• 3 結(jié)果58-64
• 4 討論64-66
• 參考文獻(xiàn)66-67
• 全文小結(jié)67-68
• 致謝68-69

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：江蘇某豬場(chǎng)2015-2016年豬流行性腹瀉病毒分子流行病學(xué)調(diào)查及基于S蛋白的抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：431485