本文關(guān)鍵詞：抗菌肽的重組表達(dá)及其生物活性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：近年來,抗生素的濫用導(dǎo)致耐藥性致病菌的進(jìn)化速度加快,細(xì)菌的耐藥性已成為世界范圍內(nèi)的健康問題。抗生素在養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用也加劇了環(huán)境污染,藥物殘留還會(huì)引發(fā)食品安全問題,因此,人們亟于開發(fā)新型抗生素替代傳統(tǒng)抗生素。抗菌肽因其作用機(jī)制獨(dú)特、不易產(chǎn)生耐藥性、對環(huán)境友好等特點(diǎn)使其成為新型抗菌藥物及綠色飼料添加劑的熱門備選。本研究選取了源于斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)抗脂多糖因子3(Anti-lipopolysaccharide factor 3,ALFpm3)作為研究對象,成功構(gòu)建ALFpm3可溶表達(dá)質(zhì)粒pET22b-ALFpm3及自聚集短肽融合表達(dá)質(zhì)粒pET22b-ALFpm3-PT 18A。以多種細(xì)菌和真菌做抗菌活性測試,結(jié)果表明E.coli origamiB(DE3)重組表達(dá)的ALFpm3粗酶液對E.coli DH5α,B.subtilis 168,S.aureus有明顯生長抑制作用。粗酶液對E.coli DH5α,B.subtilis 168,S.aureus的抑菌圈直徑分別為25 mm,23 mm,13 mm。而ALFpm3-PT 18A未顯現(xiàn)出抑菌活性。以鎳柱親和層析純化獲得重組抗菌肽ALFpm3濃度約為23μg/mL。熱穩(wěn)定測試結(jié)果顯示,重組ALFpm3經(jīng)100 oC處理3 h后,抑菌活性基本維持不變,表明其具有良好的熱穩(wěn)定性。但鑒于其表達(dá)量較低,無法用于大規(guī)模制備。以P.pastoris KM71對ALFpm3及源于眼鏡蛇(Ophiophagus hannah)毒液抗菌肽OH-CATH構(gòu)建分泌表達(dá)載體。通過Tricine-SDS-PAGE技術(shù),在搖瓶發(fā)酵上清液中未檢測到ALFpm3及OH-CATH表達(dá);但Western-blot可檢測到ALFpm3的表達(dá),但未檢測到OH-CATH表達(dá)。對含有ALFpm3表達(dá)載體的P.pastoris KM71菌株進(jìn)行高密度上罐發(fā)酵,發(fā)酵液上清重組蛋白含量約75μg/mL,較大腸桿菌有明顯提高,但抑菌活性低于大腸桿菌重組表達(dá)所得ALFpm3。本研究表明,來源于斑節(jié)對蝦的ALFpm3具有一定的抗菌活性和應(yīng)用潛質(zhì),但本研究嘗試原核(大腸桿菌)和真核(畢赤酵母)兩種表達(dá)宿主菌,均未能獲得大量有活性的ALFpm3重組肽。建議后續(xù)研究中,繼續(xù)嘗試其他宿主菌和表達(dá)載體,以進(jìn)一步研究其生物活性,為其應(yīng)用開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：抗菌肽 原核表達(dá) 真核表達(dá) 抑菌活性 上罐發(fā)酵
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S816.7
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 第一章 緒論10-23
• 1.1 引言10
• 1.2 抗菌肽的分類10-13
• 1.2.1 根據(jù)生物活性分類11-12
• 1.2.2 根據(jù)結(jié)構(gòu)分類12-13
• 1.3 抗菌肽作用機(jī)理13-15
• 1.3.1 細(xì)胞膜作用機(jī)制13-15
• 1.3.2 胞內(nèi)作用機(jī)制15
• 1.4 抗菌肽耐藥機(jī)理15-17
• 1.4.1 固有耐受機(jī)制15-16
• 1.4.2 可誘導(dǎo)耐受機(jī)制16-17
• 1.5 抗菌肽制備17-18
• 1.5.1 化學(xué)合成17
• 1.5.2 生物合成17-18
• 1.6 抗菌肽的應(yīng)用18-20
• 1.6.1 抗菌肽臨床研究18-19
• 1.6.2 抗菌肽在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用19-20
• 1.6.3 抗菌肽在畜牧業(yè)中的應(yīng)用20
• 1.7 論文研究內(nèi)容及意義20-23
• 1.7.1 研究背景及意義20-21
• 1.7.2 研究內(nèi)容21-22
• 1.7.3 技術(shù)路線22-23
• 第二章 抗菌肽ALFpm3在大腸桿菌中的克隆表達(dá)及其生物活性檢測23-48
• 2.1 引言23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料23-27
• 2.2.1 菌株與質(zhì)粒23
• 2.2.2 主要試劑23-24
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器24-25
• 2.2.4 常用溶液及培養(yǎng)基配制25-27
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法27-34
• 2.3.1 pET22b-ALFpm3的構(gòu)建27-30
• 2.3.2 pET22b-ALFpm3-PT18A的構(gòu)建30-33
• 2.3.3 E. coli感受態(tài)細(xì)胞的制備33
• 2.3.4 pET22b-ALFpm3轉(zhuǎn)化E. coli DH5α33-34
• 2.3.5 重組質(zhì)粒pET22b-ALFpm3鑒定34
• 2.4 pET22b-ALFpm3轉(zhuǎn)化E.coli origamiB(DE3)34
• 2.5 E.coli origamiB(DE3)/ pET22b-ALFpm3小量表達(dá)34-38
• 2.5.1. 小量表達(dá)34-35
• 2.5.2 Tricine-SDS-PAGE電泳分析35-36
• 2.5.3 抑菌活性檢測36-37
• 2.5.4 鎳柱親和層析純化ALFpm337-38
• 2.5.5 重組蛋白熱穩(wěn)定性測試38
• 2.6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論38-47
• 2.6.1 pET22b-ALFpm3質(zhì)粒構(gòu)建38-39
• 2.6.2 pET22b-ALFpm3-PT18A質(zhì)粒構(gòu)建39-40
• 2.6.3 E.coli origamiB(DE3)/pET22b-ALFpm3生長曲線40-41
• 2.6.4 E. coli origamiB(DE3)/pET22b-ALFpm3-PT 18A生長曲線41-42
• 2.6.5 E. coli origamiB(DE3)/pET22b-ALFpm3誘導(dǎo)表達(dá)分析42
• 2.6.6 E. coli origamiB(DE3)/pET22b-ALFpm3-PT 18A誘導(dǎo)表達(dá)分析42-43
• 2.6.7 重組蛋白抑菌活性測試43-45
• 2.6.8 重組ALFpm3熱穩(wěn)定性測試45-47
• 2.7 本章小結(jié)47-48
• 第三章 抗菌肽在畢赤酵母中的克隆表達(dá)及生物活性檢測48-66
• 3.1 引言48
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料48-52
• 3.2.1 菌株與質(zhì)粒48
• 3.2.2 主要試劑48-50
• 3.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器50
• 3.2.4 常用試劑配制50-52
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法52-60
• 3.3.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建52-55
• 3.3.2 重組質(zhì)粒篩選55-56
• 3.3.3 P. pastoris感受態(tài)細(xì)胞的制備56
• 3.3.4 P. pastoris電轉(zhuǎn)化56-58
• 3.3.5 重組菌株搖瓶發(fā)酵58
• 3.3.6 Western Blot檢測58-60
• 3.3.7 重組菌株上罐發(fā)酵60
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果60-65
• 3.4.1 pPIC9K-ALFpm3-6 His tag質(zhì)粒構(gòu)建60-62
• 3.4.2 pPIC9K- OH-CATH-6 His tag質(zhì)粒構(gòu)建62-63
• 3.4.3 P. pastoris KM71搖瓶發(fā)酵63-64
• 3.4.4 P. pastoris KM71/pPIC9K-ALFpm3-6 His tag上罐發(fā)酵64
• 3.4.5 P. pastoris KM71/pPIC9K-ALFpm3-6 His tag上罐發(fā)酵上清活性檢測64-65
• 3.5 本章小結(jié)65-66
• 結(jié)論與展望66-68
• 結(jié)論66
• 展望66-68
• 參考文獻(xiàn)68-75
• 攻讀碩士學(xué)位期間取得的研究成果75-76
• 致謝76-77
• 附件77

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本文編號：431189