本文關(guān)鍵詞：規(guī)�；翀�(chǎng)布魯氏菌病血清學(xué)調(diào)查與iELISA檢測(cè)方法的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目前我國布魯氏菌病主要的診斷方法為細(xì)菌分離培養(yǎng)和血清學(xué)檢測(cè),但滿足不了快速檢測(cè)和大群檢測(cè)的要求,且容易出現(xiàn)假陽性。為了更好的診斷和預(yù)防布魯氏菌病,需要研究新型的檢測(cè)方法來滿足快速和大群檢測(cè)的要求。1.自2013年1月—2014年12月,本實(shí)驗(yàn)室用虎紅平板凝集試驗(yàn)的方法對(duì)送檢和采集的疑似布魯氏菌病奶牛血清樣本進(jìn)行了檢測(cè),初步篩查了奶牛場(chǎng)布魯氏菌病的流行情況。共計(jì)檢測(cè)奶牛血清樣本數(shù)為8160份,其中陽性血清樣數(shù)本為1768份,占檢測(cè)總樣本數(shù)的21.67%。流產(chǎn)檢測(cè)的奶牛血清樣本數(shù)為898份,其中陽性血清樣本數(shù)為400份,占流產(chǎn)檢測(cè)總樣本數(shù)的44.54%;大群檢測(cè)的奶牛血清樣本數(shù)為7262份,其中陽性血清樣本數(shù)為1368份,占大群檢測(cè)總樣本數(shù)的18.84%。2.布魯氏菌外膜蛋白OMP16有良好的免疫原性,是亞單位疫苗的熱門候選。T4SS是布魯氏菌的胞內(nèi)寄生所必須的毒力因子。2011年,Marchesini MI等利用CyaA報(bào)告系統(tǒng)鑒定BPE123、 BPE275、BPE005和BPE043是由T4SS分泌的效應(yīng)蛋白。它們?cè)诓剪斒暇麅?nèi)運(yùn)輸過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用,其是否具有良好的免疫原性還沒有被證明。因此,本試驗(yàn)挑選了OMP16和BPE123兩個(gè)基因,純化其重組蛋白,嘗試建立間接ELISA檢測(cè)方法。據(jù)GenBank中布魯氏菌OMP16和BPE123的基因序列,設(shè)計(jì)特異性引物,擴(kuò)增OMP16和BPE123基因片段。用OMP16和BPE123基因構(gòu)建克隆質(zhì)粒,同時(shí)進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定,陽性質(zhì)粒命名為pET-T3-OMP16和pET-T3-BPE123。同時(shí)對(duì)克隆質(zhì)粒pET-T3-OMP16、pET-T3-BPE123和pET-32a(+)表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切�；厥漳康幕蚱蜲MP16、BPE123以及pET-32a(+)線性片段,用連接酶將它們連接,構(gòu)建陽性表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-OMP16和pET-32a-BPE123。隨后將二者轉(zhuǎn)入宿主菌大腸桿菌中,構(gòu)建表達(dá)菌pET-32a-OMP16-BL21和pET-32a-BPE123-BL21。用IPTG誘導(dǎo)構(gòu)建的表達(dá)菌進(jìn)行表達(dá),并對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。利用SDS-PAGE和Western-blot分析鑒定表達(dá)的蛋白。用Ni-NTASpin Kit大量純化并收集重組蛋白。以純化的蛋白OMP16和BPE123作為包被抗原,嘗試構(gòu)建iELISA檢測(cè)方法。在嘗試試驗(yàn)中確定抗原的最佳包被濃度和最佳包被條件；確定二抗的最佳稀釋度以確定及陰陽性臨界值,同時(shí)確定試驗(yàn)敏感性和試驗(yàn)重復(fù)性。用建立的iELISA方法檢測(cè)245份奶牛血清樣本,并與虎紅平板凝集試驗(yàn)作對(duì)照,判斷該方法的符合率。純化了OMP16和BPE123蛋白,成功構(gòu)建以O(shè)MP16為包被抗原的iELISA檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法與虎紅平板凝集試驗(yàn)的符合率達(dá)91.38%。BPE123蛋白在嘗試建立iELISA檢測(cè)方法時(shí),出現(xiàn)多種不能區(qū)分陰陽血清的問題,未能成功構(gòu)建BPE123蛋白的iELISA檢測(cè)方法。結(jié)論：布魯氏菌病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,布病在全國范圍內(nèi)的許多牧場(chǎng)里都有發(fā)生,且發(fā)病率有明顯的上升趨勢(shì)；在引起流產(chǎn)因素中,布病是導(dǎo)致奶牛流產(chǎn)很重要的因素。成功構(gòu)建OMP16的間接ELISA檢測(cè)方法,可作為奶牛布病血清學(xué)檢測(cè)的候選檢測(cè)方法；未能成功構(gòu)建BPE123蛋白的iELISA檢測(cè)方法,但能夠?yàn)檫M(jìn)一步探索其免疫原性以及在布魯氏菌胞內(nèi)寄生過程中的功能奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：布魯氏菌 原核表達(dá) OMP16 BPE123 間接ELISA
【學(xué)位授予單位】：寧夏大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S855.12
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 第一章 引言7-8
• 第二章 文獻(xiàn)綜述8-16
• 2.1 布魯氏菌的歷史8
• 2.2 布魯氏菌的致病機(jī)理8-9
• 2.3 布魯氏菌病的傳播9
• 2.4 布魯氏菌病的癥狀9
• 2.5 布魯氏菌病的診斷9-12
• 2.6 外膜蛋白(OMP)12-14
• 2.7 Ⅳ型分泌系統(tǒng)14-15
• 2.8 本試驗(yàn)研究的目的和意義15-16
• 第三章 布魯氏菌病的血清病學(xué)調(diào)查16-20
• 3.1 試驗(yàn)材料16
• 3.2 試驗(yàn)方法16-17
• 3.3 結(jié)果與分析17-20
• 第四章 iELISA檢測(cè)方法的建立20-37
• 4.1 試驗(yàn)材料20
• 4.2 試驗(yàn)方法20-30
• 4.3 間接ELISA檢測(cè)方法結(jié)果30-37
• 第五章 討論37-39
• 5.1 關(guān)于布魯氏菌血清學(xué)樣本37
• 5.2 關(guān)于布魯氏菌血清學(xué)調(diào)查的分析37
• 5.3 關(guān)于布魯氏菌的防控和凈化37-38
• 5.4 關(guān)于iELISA檢測(cè)方法38
• 5.5 關(guān)于布魯氏菌分泌蛋白BPE12338-39
• 第六章 結(jié)論39-40
• 6.1 布魯氏菌病血清學(xué)調(diào)查39
• 6.2 iELISA檢測(cè)方法的建立39-40
• 參考文獻(xiàn)40-46
• 致謝46-47
• 個(gè)人簡歷47

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本文編號(hào)：430873