發(fā)布時間：2017-06-07 16:02

  本文關鍵詞：WNT信號通路對豬卵母細胞體外成熟的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：卵母細胞與雄性配子不同,其可在體外條件下進行培養(yǎng)并發(fā)育成熟,同時其在生殖醫(yī)學、細胞生物學、物種保護等領域都是重點研究對象。但是在卵母細胞體外培養(yǎng)成熟的過程中,卵母細胞一旦離開卵泡環(huán)境就會發(fā)生自發(fā)性核成熟,從而造成核成熟、質成熟的不同步,因而體外培養(yǎng)成熟的卵母細胞在質和量上都不如體內(nèi)培養(yǎng)成熟的卵子。WNT信號通路組成復雜,并參與調控多種細胞活動,如細胞命運決定、分化、活力、增殖和凋亡,甚至是胚胎發(fā)育。目前,關于WNT信號通路對豬卵母細胞成熟的作用及機理仍有待研究,其對卵母細胞成熟的作用尚不明確。為了探究WNT信號通路對豬卵母細胞成熟的機制,本試驗在優(yōu)化豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系的同時,以豬卵丘卵母細胞復合體和豬顆粒細胞為研究對象,采用WNT/β-catenin通路特異性抑制劑FH535和WNT-p38MAPK抑制劑SB202190干擾WNT信號通路,試圖揭示W(wǎng)NT信號通路對豬卵母細胞體外成熟的影響。主要獲得如下結果:1.建立了成熟率為65%,卵裂率為45.5%,囊胚率為15.1%的豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系。該體系具體組成為:在TCM199基礎培養(yǎng)液中添加10%胎牛血清(FBS)、10%豬卵泡液(PFF)、100 IU/mL雙抗(青霉素+鏈霉素)、10 ng/mL表皮生長因子(EGF)、0.57 mM L-半胱氨酸(L-Cys)、2.5 IU/mL卵泡刺激素(FSH)、10 IU/mL孕馬血清素(PMSG)、10 IU/mL人絨毛膜促性腺激素(HCG)、0.91 mM丙酮酸鈉、3.05 mM葡萄糖和0.1 g/L聚乙烯醇(PVA)。培養(yǎng)方法使用敞開式凹槽玻璃皿培養(yǎng)法,激素作用方式使用44 h持續(xù)作用。2.在豬卵母細胞體外培養(yǎng)的成熟培養(yǎng)基中添加WNT/β-catenin通路的抑制劑(FH535),對豬卵丘卵母細胞復合體(COCs)進行體外培養(yǎng)。結果揭示,體外添加濃度為1μM的FH535可以顯著提高豬卵母細胞達到MII期的百分比(P0.05),此外豬卵母細胞的卵裂率與囊胚率得到提高(P0.05),囊胚內(nèi)細胞核的數(shù)量也有所增加(P0.05)。通過實時定量PCR和Western Blot分析,發(fā)現(xiàn)WNT信號通路的抑制能夠明顯促進Cdc-2、Bmp-15和Mos的基因的表達,并降低Gdf-9的表達(P0.05);β-catenin的基因表達未發(fā)生明顯變化,但是其蛋白水平的表達卻明顯受到抑制(P0.05)。由此表明,WNT/β-catenin特異性抑制劑FH535對WNT信號通路的抑制對豬卵母細胞的成熟具有促進作用。3.在體外成熟培養(yǎng)基中添加p38MAPK的抑制劑(SB202190)并對豬卵丘卵母細胞復合體(COCs)進行體外培養(yǎng)。通過體視顯微鏡觀察和實時定量PCR檢測,結果表明,體外添加濃度為20μM的SB202190明顯抑制了卵丘細胞的擴散。在經(jīng)SB202190處理后β-catenin、Cdc-2、Bmp-15、Cyclin B1、Mos和p34的表達顯著降低(P0.05),但Gdf-9的表達與對照組無明顯差異(P0.05)。通過Western Blot的檢驗,添加SB202190后,豬卵母細胞中P38MAPK的表達量顯著減少,其磷酸化的水平也明顯降低(P0.05)。4.在體外培養(yǎng)豬顆粒細胞時,分別添加0、1、10和20μM的p38MAPK特異性抑制劑SB202190。通過CCK-8試劑盒檢測豬顆粒細胞的生長活性,通過試劑盒檢測豬顆粒細胞的凋亡及周期狀況,實時定量PCR檢測生長、凋亡相關基因表達。結果顯示添加SB202190抑制了豬顆粒細胞的生長活性,且在添加20μM時差異顯著(P0.05);但是對豬顆粒細胞的凋亡未產(chǎn)生明顯影響,并與對照組比較發(fā)現(xiàn)大部分細胞被阻滯在G1/G0期,兩組間存在顯著性差異(P0.05)。實時定量PCR結果揭示,在加入SB202190后,Bax、Bcl-2和P27表達量顯著增加(P0.05),而Bcl-2和Bax的比值變化不顯著(P0.05),Fas、Fasl和Cdk-4的表達受到顯著的抑制(P0.05)。通過Western Blot分析,添加SB202190后,豬顆粒細胞p38MAPK的含量顯著減少(P0.05),其磷酸化的水平未發(fā)生改變。綜上所述,本試驗已建立能獲得較高的成熟率和卵裂率的豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系,且在體外培養(yǎng)豬卵母細胞時添加1μM的WNT/β-catenin特異性抑制劑FH535可以促進豬卵母細胞的成熟及提高其早期胚胎發(fā)育的能力,而在體外培養(yǎng)豬卵母細胞時添加20μMSB202190可通過抑制p38MAPK表達阻斷WNT信號通路從而抑制豬卵母細胞的成熟,體外培養(yǎng)豬卵泡顆粒細胞時20μM SB202190可通過阻滯其周期從而抑制其生長活性。
【關鍵詞】：WNT信號通路 豬卵母細胞 體外成熟 抑制劑 豬顆粒細胞
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S828
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-15
• 文獻綜述15-31
• 第一章 卵母細胞的成熟與早期胚胎培養(yǎng)研究進展15-25
• 1.1 卵母細胞的發(fā)生與成熟15-16
• 1.2 影響卵母細胞體外成熟的因素16-20
• 1.2.1 卵母細胞的來源16-18
• 1.2.2 培養(yǎng)條件18
• 1.2.3 其他影響因素18-20
• 1.3 卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的研究進展20
• 1.4 卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)系統(tǒng)20-21
• 1.4.1 微滴培養(yǎng)系統(tǒng)20-21
• 1.4.2 開放培養(yǎng)系統(tǒng)21
• 1.4.3 密閉培養(yǎng)系統(tǒng)21
• 1.5 卵母細胞微環(huán)境——卵母細胞與顆粒細胞之間的相互作用21-24
• 1.5.1 卵母細胞對卵丘細胞及顆粒細胞的影響21-22
• 1.5.2 卵丘細胞在卵母細胞成熟發(fā)育中的作用22-23
• 1.5.3 卵丘細胞與卵母細胞的旁分泌與縫隙連接作用23-24
• 1.6 卵母細胞激活與早期胚胎的發(fā)育24-25
• 第二章 Wnt信號通路對卵母細胞發(fā)育的的影響25-31
• 2.1 WNT對反轉發(fā)育、生理和病理過程的調節(jié)25
• 2.2 WNT信號誘導25-27
• 2.3 出生后卵巢的WNT信號調節(jié)27-28
• 2.4 WNT信號通路抑制劑與激活劑28-30
• 2.5 目前存在的主要問題及本研究的意義30-31
• 試驗研究31-66
• 第三章 豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系的建立31-41
• 3.1 前言31
• 3.2 材料與方法31-35
• 3.2.1 豬卵巢采集31-32
• 3.2.2 主要儀器與用品32
• 3.2.3 主要化學試劑32
• 3.2.4 試劑的配制32-33
• 3.2.5 豬卵母細胞的收集與培養(yǎng)33
• 3.2.6 豬卵母細胞的成熟和孤雌激活后卵裂率的觀察33-34
• 3.2.7 不同培養(yǎng)方法培養(yǎng)豬卵母細胞34
• 3.2.8 不同濃度激素配伍培養(yǎng)豬卵母細胞34
• 3.2.9 不同濃度EGF培養(yǎng)豬卵母細胞34-35
• 3.2.10不同激素處理方式培養(yǎng)豬卵母細胞35
• 3.2.11統(tǒng)計分析方法35
• 3.3 結果與分析35-38
• 3.3.1 不同培養(yǎng)方法對豬卵母細胞成熟的影響35-36
• 3.3.2 不同濃度激素配伍對豬卵母細胞成熟的影響36-37
• 3.3.3 不同濃度EGF對豬卵母細胞成熟的影響37-38
• 3.3.4 不同激素處理方式對豬卵母細胞成熟的影響38
• 3.4 討論38-40
• 3.4.1 培養(yǎng)方法對豬卵母細胞成熟的影響38-39
• 3.4.2 不同激素配伍對豬卵母細胞成熟的影響39
• 3.4.3 EGF對豬卵母細胞成熟的影響39
• 3.4.4 激素處理方式對豬卵母細胞成熟的影響39-40
• 3.5 小結40-41
• 第四章 抑制劑FH535對豬卵母細胞成熟的影響41-51
• 4.1 前言41-42
• 4.2 材料與方法42-45
• 4.2.1 豬卵巢采集42
• 4.2.2 主要儀器與用品42
• 4.2.3 主要試劑42
• 4.2.4 試劑的配制42
• 4.2.5 豬卵母細胞的收集與培養(yǎng)42-43
• 4.2.6 豬卵母細胞成熟的觀察43
• 4.2.7 豬卵母細胞孤雌激活及早期胚胎發(fā)育的觀察43
• 4.2.8 豬卵母細胞母系基因的檢測43-44
• 4.2.9 β-catenin蛋白的表達44
• 4.2.10 統(tǒng)計分析方法44-45
• 4.3 結果與分析45-49
• 4.3.1 抑制劑FH535對卵丘擴散的影響45
• 4.3.2 抑制劑FH535對豬卵母細胞成熟的影響45-47
• 4.3.3 抑制劑FH535對豬卵母細胞母系基因表達的影響47-48
• 4.3.4 抑制劑FH535對豬卵母細胞WNT信號通路 β-catenin表達的影響48-49
• 4.4 討論49-50
• 4.4.1 抑制劑FH535對卵丘擴散和豬卵母細胞成熟的影響49
• 4.4.2 抑制劑FH535對豬卵母細胞母系基因表達的影響49-50
• 4.4.3 抑制劑FH535對豬卵母細胞WNT信號通路 β-catenin表達的影響50
• 4.5 小結50-51
• 第五章 抑制劑SB202190對豬卵母細胞成熟的影響51-57
• 5.1 前言51
• 5.2 材料與方法51-52
• 5.2.1 豬卵巢采集51
• 5.2.2 主要儀器與用品51
• 5.2.3 主要試劑51-52
• 5.2.4 試劑的配制52
• 5.2.5 豬卵母細胞的收集與培養(yǎng)52
• 5.2.6 豬卵母細胞成熟的觀察52
• 5.2.7 豬卵母細胞母系基因的檢測52
• 5.2.8 p38MAPK和p-p38MAPK蛋白的表達52
• 5.2.9 統(tǒng)計分析方法52
• 5.3 結果與分析52-55
• 5.3.1 抑制劑SB202190對豬卵母細胞卵丘擴散的影響52-53
• 5.3.2 抑制劑SB202190對豬卵母細胞成熟的影響53
• 5.3.3 抑制劑SB202190對豬卵母細胞母系基因表達的影響53-54
• 5.3.4 抑制劑SB202190對豬卵母細胞p38MAPK/p-p38MAPK表達的影響54-55
• 5.4 討論55-56
• 5.4.1 抑制劑SB202190對豬卵母細胞卵丘擴散和豬卵母細胞成熟的影響55-56
• 5.4.2 抑制劑SB202190對豬卵母細胞母系基因表達的影響56
• 5.4.3 抑制劑SB202190對豬卵母細胞p38MAPK/p-p38MAPK表達的影響56
• 5.5 小結56-57
• 第六章 抑制劑SB202190對豬卵母細胞微環(huán)境-豬顆粒細胞作用的研究57-66
• 6.1 前言57
• 6.2 材料與方法57-60
• 6.2.1 豬卵巢的采集57
• 6.2.2 試劑和儀器57-58
• 6.2.3 豬顆粒細胞的分離與培養(yǎng)58
• 6.2.4 豬顆粒細胞的鑒定58
• 6.2.5 抑制劑SB202190對豬顆粒細胞生長的影響58
• 6.2.6 抑制劑SB202190對豬顆粒細胞凋亡的影響58
• 6.2.7 抑制劑SB202190對豬顆粒細胞周期的影響58-59
• 6.2.8 抑制劑SB202190對豬顆粒細胞相關基因表達的影響59
• 6.2.9 抑制劑SB202190對豬顆粒細胞p38MAPK/p-p38MAPK表達的影響59-60
• 6.2.10統(tǒng)計分析方法60
• 6.3 結果與分析60-64
• 6.3.1 豬卵巢顆粒細胞培養(yǎng)及形態(tài)學觀察60-61
• 6.3.2 豬卵巢顆粒細胞的鑒定61
• 6.3.3 抑制劑SB202190處理對豬卵巢顆粒細胞增殖活力的影響61
• 6.3.4 抑制劑SB202190處理對豬卵巢顆粒細胞凋亡的影響61-62
• 6.3.5 抑制劑SB202190對豬卵巢顆粒細胞周期的影響62
• 6.3.6 抑制劑SB202190對豬顆粒細胞凋亡、周期相關基因表達的影響62-63
• 6.3.7 抑制劑SB202190對豬顆粒細胞p38MAPK/p-p38MAPK表達的影響63-64
• 6.4 討論64-65
• 6.4.1 抑制劑SB202190對豬顆粒細胞生長、凋亡、周期的影響64
• 6.4.2 抑制劑SB202190對豬顆粒細胞凋亡、周期相關基因表達的影響64
• 6.4.3 抑制劑SB202190對豬顆粒細胞p38MAPK/p-p38MAPK表達的影響64-65
• 6.5 小結65-66
• 結論66-67
• 創(chuàng)新點67-68
• 參考文獻68-78
• 縮略詞78-79
• 致謝79-80
• 作者簡介80

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