本文關(guān)鍵詞：豬MELK催化結(jié)構(gòu)域的克隆表達(dá)及其與豬BCL-G共轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：母系胚胎亮氨酸拉鏈激酶(Maternal embryonic leucine zipper kinase,MELK),在鼠上叫做鼠源蛋白絲/蘇氨酸激酶38(MPK38),在非洲爪蟾中也叫做pEg3,是細(xì)胞周期依賴蛋白激酶KIN1/PAR-1/MARK家族中的一個(gè)成員,在多種特異干細(xì)胞和癌細(xì)胞中高度表達(dá)。MELK廣泛參與細(xì)胞的變化過(guò)程,其中包括細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、剪接體組裝、基因表達(dá)、胚胎發(fā)育、造血作用和腫瘤形成等。在乳腺癌細(xì)胞中MELK可以直接磷酸化BCL-GL,抑制BCL-GL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。本實(shí)驗(yàn)室已克隆出豬MELK(pMELK)和豬BCL-G(pBCL-G),并通過(guò)免疫共沉淀和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)證明了pMELK能與pBCL-G發(fā)生相互作用,而后抑制pBCL-G的促凋亡作用。為研究pMELK催化結(jié)構(gòu)域是否會(huì)抑制pBCL-G的促凋亡作用,本研究運(yùn)用真核表達(dá)載體構(gòu)建和流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù),來(lái)探究過(guò)表達(dá)pMELK催化結(jié)構(gòu)域(catalytic domain,cd)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。研究結(jié)果如下:1.為獲得穩(wěn)定表達(dá)pBCL-G基因的細(xì)胞株,本實(shí)驗(yàn)對(duì)存放超過(guò)兩年的細(xì)胞株進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性檢測(cè)。結(jié)果表明,pBCL-G基因能夠持續(xù)穩(wěn)定表達(dá),為后續(xù)基因功能的研究奠定基礎(chǔ)。2.本實(shí)驗(yàn)將pMELK的催化結(jié)構(gòu)域連接到pCMV-HA真核表達(dá)載體,構(gòu)建重組載體pCMV-HA-MELK-cd。采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至豬臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(SUVECs)。48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行裂解,western blot檢測(cè)融合蛋白pCMV-HA-MELK-cd的表達(dá)情況。3.我們將pCMV-HA空載體(陰性對(duì)照組)、pCMV-HA-pMELK-cd(實(shí)驗(yàn)組)和pCMV-HA-pMELK(陽(yáng)性對(duì)照組)載體轉(zhuǎn)染至穩(wěn)定表達(dá)GFP-pBCL-G的SUVEC細(xì)胞中,分別用500 nM的STS誘導(dǎo)18 h后收集細(xì)胞,并進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pMELK的催化結(jié)構(gòu)域不能抑制pBCL-G的促凋亡作用。
【關(guān)鍵詞】：豬MELK基因 催化結(jié)構(gòu)域 真核表達(dá) 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.2
【目錄】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-9
• 文獻(xiàn)綜述9-14
• 第一章 MELK的研究進(jìn)展9-14
• 1.1 MELK概述9
• 1.2 MELK在細(xì)胞凋亡中的作用9-12
• 1.2.1 MELK蛋白與BCL-G等多種蛋白發(fā)生相互作用9-11
• 1.2.2 MELK在癌癥中發(fā)揮重要作用11-12
• 1.2.3 MELK可以調(diào)控細(xì)胞周期12
• 1.2.4 MELK參與胚胎發(fā)育12
• 1.3 MELK的研究前景12-13
• 1.4 MELK的研究意義13-14
• 試驗(yàn)研究14-31
• 第二章 表達(dá)豬BCL-G蛋白細(xì)胞株的穩(wěn)定性檢測(cè)14-17
• 2.1 材料14-15
• 2.1.1 細(xì)胞株和載體14
• 2.1.2 主要試劑14
• 2.1.3 主要儀器14-15
• 2.2 方法15-16
• 2.2.1 Western blot檢測(cè)鑒定穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株15-16
• 2.2.2 Western blot檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)GFP-pBCL-G細(xì)胞株的穩(wěn)定性16
• 2.3 結(jié)果16
• 2.4 討論16
• 2.5 小結(jié)16-17
• 第三章 豬MELK催化結(jié)構(gòu)域在SUVEC細(xì)胞中的表達(dá)17-26
• 3.1 材料17-18
• 3.1.1 細(xì)胞株和載體17
• 3.1.2 主要試劑17-18
• 3.1.3 主要儀器18
• 3.2 方法18-23
• 3.2.1 構(gòu)建pMELK-cd真核表達(dá)載體18-22
• 3.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染22-23
• 3.2.3 Western blot檢測(cè)pMELK-cd蛋白23
• 3.3 結(jié)果23-24
• 3.3.1 重組質(zhì)粒pCMV-HA-pMELK-cd雙酶切鑒定和測(cè)序結(jié)果23
• 3.3.2 重組質(zhì)粒濃度檢測(cè)結(jié)果23-24
• 3.3.3 Western blot鑒定結(jié)果24
• 3.4 討論24-25
• 3.5 小結(jié)25-26
• 第四章 豬MELK催化結(jié)構(gòu)域蛋白對(duì)豬BCL-G蛋白介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究26-31
• 4.1 材料26-27
• 4.1.1 細(xì)胞株和載體26
• 4.1.2 主要試劑26-27
• 4.1.3 主要儀器27
• 4.2 方法27-28
• 4.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染27
• 4.2.2 HA-pMELK、HA-pMELK-cd融合蛋白在真核細(xì)胞中的表達(dá)27
• 4.2.3 STS誘導(dǎo)共表達(dá)pBCL-G和pCMV-HA、p MELK-cd、pMELK的細(xì)胞27
• 4.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率27-28
• 4.3 結(jié)果28-30
• 4.3.1 質(zhì)粒濃度檢測(cè)結(jié)果28
• 4.3.2 Western blot鑒定結(jié)果28-29
• 4.3.3 STS誘導(dǎo)的過(guò)表達(dá)pMELK-cd和pBCL-G蛋白的細(xì)胞凋亡率檢測(cè)29-30
• 4.4 討論30
• 4.5 小結(jié)30-31
• 結(jié)論31-32
• 參考文獻(xiàn)32-35
• 縮略詞35-37
• 試劑配方37-40
• 致謝40-42
• 作者簡(jiǎn)介42

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本文編號(hào)：416548