本文關(guān)鍵詞：產(chǎn)氣莢膜梭菌不同毒素型多重PCR和α毒素抗體ELISA檢測方法的建立及初步應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：產(chǎn)氣莢膜梭菌可引起人畜多種疾病,致病作用由毒素引起,主要致死毒素為α、β、ε和ι。根據(jù)產(chǎn)生這4種毒素的能力將本菌分為A、B、C、D和E 5個型。為了快速檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌、分型以及疫苗免疫后α毒素抗體的評價,本研究分別建立了產(chǎn)氣莢膜梭菌不同毒素型多重PCR檢測方法和α毒素抗體ELISA檢測方法,獲得了以下結(jié)果:1.羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌不同毒素型多重PCR檢測方法的建立設(shè)計α、β、ε和ι毒素基因特異性引物,優(yōu)化試驗條件,建立產(chǎn)氣莢膜梭菌不同毒素型多重PCR方法。特異性試驗表明,該方法對A型、B型、C型、D型和E型產(chǎn)氣莢膜梭菌標準菌株均擴增出了相應(yīng)的目的條帶,而諾維梭菌、腐敗梭菌和滅菌雙蒸水均擴增不到任何條帶;靈敏性試驗表明,該方法對A型、B型、C型、D型和E型標準菌株基因組DNA最低檢測量分別為9.0 pg、17.8 pg、12.2 pg、13.8 pg和18.5 pg;重復(fù)性試驗表明該方法有很好的重復(fù)性。應(yīng)用所建立的方法從21份羊臨床病料中檢測到9株A型和1株C型產(chǎn)氣莢膜梭菌。本研究建立的多重PCR方法可以進行產(chǎn)氣莢膜梭菌的快速檢測及5種毒素型的鑒別。2.產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的原核表達及純化復(fù)性根據(jù)GenBank已公布的產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素基因序列,設(shè)計成熟肽引物,PCR擴增后構(gòu)建pET-28a-α重組質(zhì)粒,鑒定后,轉(zhuǎn)化BL21(DE3),經(jīng)誘導(dǎo)優(yōu)化,純化和復(fù)性,進行SDS-PAGE和Western blot分析。結(jié)果表明,成功克隆了產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素成熟肽基因片段;IPTG誘導(dǎo)濃度對重組蛋白表達的影響不大,誘導(dǎo)7 h最佳;表達形式為包涵體;純化復(fù)性的α毒素重組蛋白能與產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性血清特異性結(jié)合,反應(yīng)原性良好。3.產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素抗體間接ELISA檢測方法的建立以α毒素重組蛋白為包被抗原,建立α毒素抗體間接ELISA檢測方法。優(yōu)化間接ELISA最佳反應(yīng)條件為:抗原按5.0μg/mL稀釋包被,血清按1∶50稀釋和酶標二抗1∶5000稀釋;37℃封閉1 h,抗原抗體孵育1 h,TMB顯色30 min。間接ELISA方法的臨界值為0.393,特異性為96.5%,敏感性為98%,批內(nèi)C.V在2%~3%之間,批間C.V小于8%。用建立的間接ELISA方法對521份山羊血清樣本的檢測結(jié)果表明陽性率為92.7%。本試驗成功建立了產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素抗體間接ELISA檢測方法,并初步應(yīng)用。
【關(guān)鍵詞】：產(chǎn)氣莢膜梭菌 多重PCR α毒素 原核表達 間接ELISA
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-12
• 文獻綜述12-17
• 第一章 產(chǎn)氣莢膜梭菌研究進展12-17
• 1.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌的定型方法12-13
• 1.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素13-17
• 1.2.1 生物學(xué)特性13
• 1.2.2 N末端和C末端的結(jié)構(gòu)及功能13-14
• 1.2.3 基因定點突變14-15
• 1.2.4 基因克隆與表達15-17
• 試驗研究17-38
• 第二章 羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌不同毒素型多重PCR檢測方法的建立17-25
• 2.1 材料17
• 2.1.1 菌株17
• 2.1.2 主要試劑17
• 2.1.3 臨床樣品17
• 2.2 方法17-20
• 2.2.1 菌株培養(yǎng)與模板制備17
• 2.2.2 引物的設(shè)計與合成17-18
• 2.2.3 單項PCR檢測方法的建立18-19
• 2.2.4 多重PCR條件優(yōu)化19
• 2.2.5 特異性試驗19
• 2.2.6 敏感性試驗19-20
• 2.2.7 重復(fù)性試驗20
• 2.2.8 臨床樣品檢測20
• 2.3 結(jié)果20-23
• 2.3.1 單項PCR擴增結(jié)果20
• 2.3.2 多重PCR引物濃度的優(yōu)化結(jié)果20-21
• 2.3.3 多重PCR退火溫度優(yōu)化結(jié)果21
• 2.3.4 特異性試驗結(jié)果21-22
• 2.3.5 敏感性試驗結(jié)果22
• 2.3.6 重復(fù)性試驗結(jié)果22-23
• 2.3.7 多重PCR的臨床應(yīng)用23
• 2.4 討論23-24
• 2.5 小結(jié)24-25
• 第三章 產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的原核表達及純化復(fù)性25-33
• 3.1 材料25
• 3.1.1 主要試劑25
• 3.1.2 陽性血清25
• 3.2 方法25-29
• 3.2.1 引物設(shè)計與合成25-26
• 3.2.2 α毒素成熟肽基因片段的擴增26
• 3.2.3 重組表達載體的構(gòu)建26-27
• 3.2.4 α毒素重組蛋白誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化27
• 3.3.5 α毒素重組蛋白表達形式的分析及純化27-28
• 3.2.6 α毒素重組蛋白的復(fù)性28
• 3.2.7 α毒素重組蛋白的Western blot分析28-29
• 3.3 結(jié)果29-31
• 3.3.1 PCR擴增結(jié)果29
• 3.3.2 原核重組質(zhì)粒的鑒定29
• 3.3.3 α毒素重組蛋白誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化29-30
• 3.3.4 α毒素重組蛋白表達形式的分析及純化30-31
• 3.3.5 重組蛋白的Western blot分析31
• 3.4 討論31-32
• 3.5 小結(jié)32-33
• 第四章 產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素抗體間接ELISA檢測方法的建立33-38
• 4.1 材料33
• 4.1.1 主要試劑33
• 4.1.2 血清33
• 4.2 方法33-35
• 4.2.1 抗原、血清和酶標二抗工作濃度的確定33-34
• 4.2.2 其他試驗條件的優(yōu)化34
• 4.2.3 間接ELISA方法臨界值的確定34
• 4.2.4 特異性試驗34-35
• 4.2.5 敏感性試驗35
• 4.2.6 批內(nèi)、批間重復(fù)性試驗35
• 4.2.7 臨床樣本檢測35
• 4.3 結(jié)果35-36
• 4.3.1 抗原、血清和酶標二抗的最佳工作濃度35
• 4.3.2 其他試驗條件的優(yōu)化35
• 4.3.3 間接ELISA方法的臨界值35-36
• 4.3.4 間接ELISA方法的特異性、敏感性和重復(fù)性36
• 4.3.5 臨床樣本檢測36
• 4.4 討論36-37
• 4.5 小結(jié)37-38
• 結(jié)論38-39
• 參考文獻39-43
• 附錄43-46
• 致謝46-48
• 作者簡介48

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