本文關(guān)鍵詞：豬偽狂犬病病毒gE基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)及阻斷gE-ELISA方法的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬偽狂犬病是一種主要引起公豬不育、母豬流產(chǎn)死胎、新生仔豬大量死亡、育肥豬生長(zhǎng)停滯的一種危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一。近些年來(lái),偽狂犬病在我國(guó)呈爆發(fā)流行趨勢(shì),給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大損失。gE基因是偽狂犬病毒11個(gè)囊膜糖蛋白中一個(gè)十分重要的毒力蛋白基因。當(dāng)前市場(chǎng)上PRV大部分的弱毒疫苗和滅活疫苗均有缺失gE基因,但因?yàn)閭慰袢哂袧摲腥拘?單純使用疫苗并不能根除PRV。因此,結(jié)合相應(yīng)的區(qū)分野毒感染豬和疫苗免疫豬的鑒別診斷方法,堅(jiān)決淘汰PRV野毒感染豬是根除偽狂犬的根本措施。目前,我國(guó)的PRV野毒鑒別診斷主要依賴于進(jìn)口國(guó)外昂貴的試劑盒,開(kāi)發(fā)出能準(zhǔn)確鑒別PRV野毒的國(guó)產(chǎn)診斷試劑盒十分必要。本研究通過(guò)將PRV gE基因克隆至pFastBac/HBM-TOPO載體,轉(zhuǎn)化含有桿狀病毒穿梭質(zhì)粒的DH10BacTM E.coli,通過(guò)三重抗性和藍(lán)白斑篩選,得到含有PRV gE基因的重組Bacmid,將其轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞,獲得重組桿狀病毒。分別用間接免疫熒光(IFA)、SDS-PAGE和Western blot方法,對(duì)重組桿狀病毒表達(dá)的蛋白進(jìn)行鑒定和分析,結(jié)果表明:g E蛋白在Sf9細(xì)胞中得到高效表達(dá),并且具有良好反應(yīng)原性。使用經(jīng)過(guò)蔗糖梯度密度離心純化的PRV病毒免疫6-8周齡BALB/c小鼠,4次免疫后取小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合,以表達(dá)gE蛋白作為抗原建立的間接ELISA方法篩選陽(yáng)性細(xì)胞克隆,經(jīng)過(guò)三次亞克隆獲得了3株穩(wěn)定分泌gE單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1H1、7D4、5F2。通過(guò)相對(duì)親和力測(cè)定和IFA效價(jià)檢測(cè),結(jié)果1H1單抗和gE蛋白的相對(duì)親和力最強(qiáng),IFA的效價(jià)最高,達(dá)1:1600。對(duì)1H1單抗的生物學(xué)特性鑒定表明:其染色體數(shù)目正常,抗體亞類其重鏈為IgG1,輕鏈為κ。IFA特異性鑒定表明其具有良好的特異性。采用改良過(guò)碘酸鈉法將1H1 gE單抗進(jìn)行HRP酶標(biāo)記,以gE蛋白作為包被抗原,建立了PRV gE阻斷ELISA方法。對(duì)常見(jiàn)的豬病毒病CSFV、PPV、PRRSV、JEV的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果檢測(cè)均為陰性,表明本方法具有良好的特異性。和IDEXX PRV gpI抗體檢測(cè)試劑盒的敏感性對(duì)比試驗(yàn)顯示:本方法具有較好的敏感性。對(duì)238份臨床血清樣品的檢測(cè)結(jié)果表明:本方法與國(guó)外IDEXX PRV gpI抗體檢測(cè)試劑盒總體符合率達(dá)到了90.34%。綜上,本方法可用于PRV野毒感染和疫苗毒免疫的鑒別診斷,為我國(guó)準(zhǔn)確鑒別偽狂犬野毒的gE-ELISA診斷試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：豬偽狂犬病 gE基因 桿狀病毒表達(dá) 單克隆抗體 阻斷ELISA
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 致謝4-7
• 摘要7-8
• 文獻(xiàn)綜述8-17
• 1 偽狂犬病概述8-9
• 2 偽狂犬病病毒9-11
• 3 豬偽狂犬疫苗研究進(jìn)展11-13
• 4 豬偽狂犬病野毒感染鑒別診斷方法研究進(jìn)展13-16
• 5 本研究的目的和意義16-17
• 試驗(yàn)研究17-46
• 試驗(yàn)一：偽狂犬病病毒gE基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)17-28
• 1 材料17
• 2 方法17-23
• 3 結(jié)果23-26
• 4 討論26-28
• 試驗(yàn)二：PRV gE單克隆抗體的制備28-38
• 1 材料28
• 2 方法28-33
• 3 結(jié)果33-36
• 4 討論36-38
• 試驗(yàn)三：阻斷gE-ELISA方法的建立38-46
• 1 材料38
• 2 方法38-40
• 3 結(jié)果40-44
• 4 討論44-46
• 全文總結(jié)46-47
• 參考文獻(xiàn)47-55
• 附：作者讀研期間發(fā)表文章55-56
• 英文縮寫詞表56-57
• ABSTRACT57-58

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  本文關(guān)鍵詞：豬偽狂犬病病毒gE基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)及阻斷gE-ELISA方法的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：402316