本文關(guān)鍵詞：山羊Boule基因新轉(zhuǎn)錄本的鑒定及其功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：Boule基因是精子減數(shù)分裂過程中的一個保守基因,編碼RNA結(jié)合蛋白,該基因的缺失會阻斷精子發(fā)生的減數(shù)分裂過程,從而導(dǎo)致雄性生殖能力下降。研究表明,Boule基因在人、牛和蝙蝠等哺乳動物上都存在可變剪接(alternative splicing,AS),且其甲基化與犏牛雄性不育有關(guān);然而,目前關(guān)于山羊Boule基因的可變剪接及其功能、單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)和甲基化研究未見報道。因此,本研究以西農(nóng)薩能奶山羊等不同山羊品種為研究對象,利用DNA測序、實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)、重亞硫酸氫鹽測序(bisulfite sequencing PCR,BSP)等技術(shù),結(jié)合生物信息學(xué)方法,鑒定Boule基因的新轉(zhuǎn)錄本及其m RNA表達水平,并分析不同轉(zhuǎn)錄本與遺傳變異、啟動子區(qū)甲基化修飾的關(guān)系。此外,本研究還構(gòu)建了不同轉(zhuǎn)錄本的超表達載體,并轉(zhuǎn)染模式動物小鼠生殖細胞系,分析不同轉(zhuǎn)錄本對減數(shù)分裂相關(guān)基因m RNA表達的影響,從而為深入研究Boule基因的調(diào)控機理提供科學(xué)資料,為山羊遺傳育種與繁殖提供參考。1.山羊Boule基因新轉(zhuǎn)錄本的鑒定及其mRNA表達研究由于Boule基因在睪丸組織中特異性表達,故以西農(nóng)薩能奶山羊睪丸cDNA池為模板,擴增Boule基因CDS區(qū),發(fā)現(xiàn)3個新轉(zhuǎn)錄本,分別命名為Boule-a,Boule-b和Boule-c。與參考序列(NC_022294)相比,Boule-a缺失第7、8外顯子,Boule-b缺失第8外顯子,而Boule-c僅保留了第1、2外顯子。qRT-PCR揭示Boule基因不同轉(zhuǎn)錄本在睪丸組織中差異性表達,Boule-a與Boule-b、Boule-ab的表達量存在顯著差異,且Boule-b為Boule基因在睪丸組織中存在的主要轉(zhuǎn)錄本形式。2.山羊Boule基因新轉(zhuǎn)錄本mRNA表達與遺傳變異的關(guān)系以西農(nóng)薩能奶山羊、關(guān)中奶山羊、海南黑山羊、內(nèi)蒙古白絨山羊等不同品種為實驗對象,發(fā)現(xiàn)山羊Boule基因2個新SNPs位點,分別位于第2內(nèi)含子(NC_022294:g.7243)和第5內(nèi)含子(NC_022294:g.12350),而且這些SNPs對山羊生產(chǎn)性狀有顯著影響(P0.05),可作為山羊生產(chǎn)性狀早期選擇的分子標(biāo)記。利用DNA測序法對睪丸個體Boule基因的SNPs位點進行分型,并分析不同轉(zhuǎn)錄本mRNA表達量與遺傳變異間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn),第5內(nèi)含子處SNP3-P5(NC_022294:g.12350)位點顯著影響B(tài)oule-ab總的m RNA表達量(P0.05)。3.山羊Boule基因新轉(zhuǎn)錄本mRNA表達與啟動子區(qū)甲基化的關(guān)系Boule基因啟動子區(qū)在睪丸組織中呈高甲基化狀態(tài)(90%以上)。相關(guān)分析表明,啟動子區(qū)整體甲基化水平與轉(zhuǎn)錄本總mRNA表達量之間呈負相關(guān),且第3個CpG位點(CpG3)和第7個CpG位點(CpG7)位點與轉(zhuǎn)錄本a和b總的表達量Boule-ab有顯著的相關(guān)性(P0.05)。4.山羊Boule基因新轉(zhuǎn)錄本對雄性小鼠GC-1細胞減數(shù)分裂基因表達的影響分別構(gòu)建了CD513B-Boule-a和CD513B-Boule-b,CD513B-Boule-c的超表達載體并轉(zhuǎn)染模式動物小鼠的生殖細胞GC-1細胞,同時分析Boule基因不同轉(zhuǎn)錄本和減數(shù)分裂相關(guān)基因表達量的變化。由于Boule-b轉(zhuǎn)錄本的超表達載體轉(zhuǎn)染效率低,故只對超表達Boule-a和Boule-c轉(zhuǎn)錄本進行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染CD513B-Boule-a和CD513B-Boule-c后,減數(shù)分裂相關(guān)基因CDC2的表達量顯著下調(diào)(P0.01),推測這兩種轉(zhuǎn)錄本可能抑制減數(shù)分裂。
【關(guān)鍵詞】：山羊 Boule基因 可變剪接(AS) 遺傳變異 DNA甲基化 功能研究
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S827
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 文獻綜述12-23
• 第一章 可變剪接與Boule基因研究進展12-23
• 1.1 我國山羊產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀12
• 1.2 可變剪接的研究進展12-16
• 1.2.1 可變剪接的概念和發(fā)展12-13
• 1.2.2 可變剪接方式與內(nèi)含子調(diào)控可變剪接機制13-14
• 1.2.3 可變剪接外顯子特征14-15
• 1.2.4 可變剪接的功能15-16
• 1.2.5 可變剪接的檢測方法16
• 1.3 可變剪接的影響因素16-19
• 1.3.1 可變剪接與遺傳變異16-18
• 1.3.2 可變剪接與表觀遺傳修飾18-19
• 1.4 Boule基因的研究進展19-21
• 1.4.1 Boule基因的結(jié)構(gòu)特征20
• 1.4.2 Boule基因的細胞組織定位20-21
• 1.4.3 Boule基因的功能及研究進展21
• 1.5 本研究的目的和意義21-23
• 試驗研究23-61
• 第二章 山羊Boule基因新轉(zhuǎn)錄本的鑒定及mRNA表達差異研究23-35
• 2.1 材料與方法23-26
• 2.1.1 試驗材料23
• 2.1.2 試驗方法23-26
• 2.2 結(jié)果與分析26-33
• 2.2.1 總RNA質(zhì)量檢測26
• 2.2.2 山羊Boule基因可變剪接的預(yù)測與鑒定26-27
• 2.2.3 生物信息分析27-32
• 2.2.4 不同轉(zhuǎn)錄本mRNA表達差異研究32-33
• 2.3 討論33-34
• 2.4 小結(jié)34-35
• 第三章 山羊Boule基因新轉(zhuǎn)錄本mRNA表達與遺傳變異的關(guān)系35-45
• 3.1 材料與方法35-39
• 3.1.1 試驗材料35-36
• 3.1.2 試驗方法36-39
• 3.2 結(jié)果與分析39-42
• 3.2.1 Boule基因的多態(tài)性檢測39-40
• 3.2.2 Boule基因各SNP位點分型40-41
• 3.2.3 各SNP位點的群體遺傳學(xué)分析以及與山羊生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析41-42
• 3.2.4 不同轉(zhuǎn)錄本m RNA表達與SNP的關(guān)系42
• 3.3 討論42-44
• 3.4 小結(jié)44-45
• 第四章 山羊Boule基因新轉(zhuǎn)錄本mRNA表達與啟動子甲基化的關(guān)系45-52
• 4.1 材料與方法45-47
• 4.1.1 試驗材料45
• 4.1.2 試驗方法45-47
• 4.2 結(jié)果與分析47-50
• 4.2.1 TA克隆結(jié)果47
• 4.2.2 亞硫酸氫鹽（BSP）PCR測序結(jié)果及序列比對47-48
• 4.2.3 Boule基因啟動子區(qū)甲基化模式圖48-49
• 4.2.4 不同轉(zhuǎn)錄本m RNA表達與DNA甲基化的關(guān)系49-50
• 4.3 討論50-51
• 4.4 小結(jié)51-52
• 第五章 山羊Boule基因新轉(zhuǎn)錄本對雄性小鼠GC-1 細胞減數(shù)分裂基因表達的影響52-61
• 5.1 材料與方法52-56
• 5.1.1 試驗材料52
• 5.1.2 試驗方法52-56
• 5.2 結(jié)果與分析56-59
• 5.2.1 CD513B-cmv U6超表達載體構(gòu)建56
• 5.2.2 載體轉(zhuǎn)染GC-1 細胞系56-57
• 5.2.3 CD513B-Boule-a和CD513B-Boule-c超表達效率的檢測57-58
• 5.2.4 減數(shù)分裂相關(guān)基因表達分析58-59
• 5.3 討論59-60
• 5.4 小結(jié)60-61
• 結(jié)論及創(chuàng)新點61-62
• 本研究得到以下結(jié)論61
• 創(chuàng)新點61
• 下一步研究計劃61-62
• 參考文獻62-72
• 附錄72-88
• 致謝88-90
• 個人簡介90-91

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本文編號：402591