根據(jù)本實驗室構(gòu)建的鴨腸炎病毒基因文庫的序列信息,設(shè)計DEVgN基因的特異性引物,對DEV gN基因（GenBank登錄號EU195112）進行PCR擴增,并分析了DEVgN基因的分子特征和密碼子偏嗜性,并且開展了以下研究：gN基因在DEV感染鴨胚成纖維細胞過程中的轉(zhuǎn)錄時相,編碼的gN蛋白在宿主DEF中的細胞定位以及gN蛋白與gM蛋白在宿主DEF中的共定位研究；在這些研究基礎(chǔ)上,建立和優(yōu)化了基于gN基因的DEV PCR診斷方法。獲得的結(jié)果如下： 1. DEV gN基因的克隆及分子特征分析構(gòu)建DEV gN基因的T克隆質(zhì)粒（pUCm-T/gN）,該基因大小為288bp,編碼蛋白為95aa。編碼的gN蛋白含有一個保守區(qū)域,屬于Herpes_UL49.5superfamily,含有1個信號肽區(qū)和2個跨膜區(qū),5個磷酸化位點。亞細胞定位預(yù)測結(jié)果顯示該蛋白66.7%存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。系統(tǒng)進化樹表明DEVgN基因與α皰疹病毒亞科中CeHV-1gN基因和HSV-3gN基因的親緣性最高；DEVgN蛋白在進化上與a皰疹病毒亞科中的MeHV-1gN蛋白親緣性最高。 2. DEV gN基因的...

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
第一部分 文獻綜述
    第一章 皰疹病毒gN基因及其編碼蛋白的研究進展
        1 引言
        2 皰疹病毒gN基因及其編碼蛋白的特點
            2.1 皰疹病毒gN基因的特點
            2.2 皰疹病毒gN蛋白的特點
        3 皰疹病毒gN蛋白的功能
            3.1 在抗原呈遞過程中的病毒免疫逃避作用
            3.2 與gM蛋白作用發(fā)揮重要功能
                3.2.1 糖蛋白復(fù)合物gM/gN的形成方式
                3.2.2 在蛋白成熟過程中與gM蛋白相互影響
                3.2.3 在病毒的復(fù)制、感染和細胞間感染中的作用
                3.2.4 糖蛋白復(fù)合物gM/gN抑制細胞融合
        4 選題目的和意義
第二部分 試驗研究
    第二章 鴨腸炎病毒gN基因的克隆及其分子特征分析
        1 材料
            1.1 基因文庫/菌株/毒株/載體
            1.2 實驗動物
            1.3 主要試劑
            1.4 主要生物信息學(xué)分析軟件
            1.5 主要儀器
        2 試驗方法
            2.1 DEV gN基因的擴增
                2.1.1 鴨胚成纖維細胞的制備
                2.1.2 接種DEV
                2.1.3 DEV DNA的提取
                2.1.4 引物的設(shè)計與合成
                2.1.5 DEV gN基因的PCR擴增
            2.2 DEV gN基因的T克隆
                2.2.1 目的DNA片段的回收
                2.2.2 制備感受態(tài)細胞DH5α
                2.2.3 連接
                2.2.4 重組T克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α
            2.3 重組T克隆質(zhì)粒的鑒定
                2.3.1 重組T克隆質(zhì)粒的酶切鑒定
                2.3.2 重組T克隆質(zhì)粒的PCR鑒定
            2.4 DEV gN基因的生物信息學(xué)分析
                2.4.1 DEV gN基因序列的分子特性分析
                2.4.2 DEV gN蛋白序列的分子特性分析
        3 結(jié)果
            3.1 DEV gN基因的擴增
            3.2 DEV gN基因的T克隆質(zhì)粒鑒定
            3.3 DEV gN基因的分子特征分析
            3.4 DEV gN蛋白的分子特征分析
                3.4.1 DEV gN蛋白的理化性質(zhì)分析
                3.4.2 DEV gN蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測
                3.4.3 DEV gN蛋白的信號肽及跨膜區(qū)的預(yù)測
                3.4.4 DEV gN蛋白的翻譯后修飾位點的預(yù)測
                3.4.5 DEV gN蛋白的抗原性分析
                3.4.6 DEV gN蛋白的二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測
                3.4.7 DEV gN蛋白的亞細胞定位預(yù)測
                3.4.8 DEV gN蛋白的相似性及系統(tǒng)進化分析
            3.5 DEV gN基因的密碼子偏嗜性分析
        4 討論
            4.1 關(guān)于DEV gN基因的引物設(shè)計及T克隆
            4.2 DEV gN基因及其編碼蛋白的分子特征分析
            4.3 DEV gN基因的密碼子偏嗜性分析
    第三章 鴨腸炎病毒gY基因在DEF中轉(zhuǎn)錄時相的研究
        1 材料與儀器
            1.1 材料
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器
        2 方法
            2.1 DEF的制備
            2.2 接種DEV
            2.3 RNA的提取及測定
            2.4 Real-time qRT-PCR檢測DEV gN基因的轉(zhuǎn)錄時相
                2.4.1 樣品cDNA的獲得
                2.4.2 引物設(shè)計與合成
                2.4.3 引物特異性檢測
                2.4.4 標準品的制備
                2.4.5 標準曲線的制作
                2.4.6 Real-time qRT-PCR反應(yīng)
                2.4.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
        3 結(jié)果
            3.1 引物特異性檢測
            3.2 RNA完整性及純度檢測分析
            3.3 Real-time qRT-PCR標準曲線建立
            3.4 DEV gN基因在DEF中的定量檢測
            3.5 數(shù)據(jù)處理
        4 討論
            4.1 轉(zhuǎn)錄時相的研究方法
            4.2 標準曲線分析
            4.3 DEV gN基因的轉(zhuǎn)錄時相分析
    第四章 鴨腸炎病毒gN蛋白在DEF中的細胞定位分析
        1 材料
            1.1 毒株/質(zhì)粒/試驗動物
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器
        2 方法
            2.1 重組真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建路線圖
            2.2 重組真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建
                2.2.1 引物設(shè)計與合成
                2.2.2 DEV gN基因片段和真核表達載體的酶切處理
                2.2.3 制備感受態(tài)細胞DH5α
                2.2.4 連接
                2.2.5 重組真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α
            2.3 重組真核表達質(zhì)粒的鑒定
                2.3.1 重組真核表達質(zhì)粒的酶切鑒定
                2.3.2 重組真核表達質(zhì)粒的PCR鑒定
            2.4 DEF的制備
            2.5 轉(zhuǎn)染試劑制備
            2.6 重組真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DEF
            2.7 熒光信號檢測
        3 結(jié)果
            3.1 重組表達質(zhì)粒pEGFP-C1/gN的鑒定
            3.2 DEV gN蛋白的細胞定位
        4 討論
            4.1 蛋白定位的研究方法
            4.2 DEV gN蛋白的細胞定位分析
    第五章 鴨腸炎病毒gN蛋白與gM蛋白的共定位分析
        1 材料
            1.1 毒株/質(zhì)粒/試驗動物
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器
        2 方法
            2.1 DEV gM基因的擴增
                2.1.1 引物設(shè)計與合成
                2.1.2 DEV gM基因的PCR擴增
            2.2 重組表達質(zhì)粒pDsRed1-N1/gM的構(gòu)建路線圖
            2.3 DEV gM基因的重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建
                2.3.1 制備感受態(tài)細胞DH5α
                2.3.2 DEV gM基因片段和真核表達載體的酶切處理
                2.3.3 連接
                2.3.4 重組真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α
            2.4 DEV gM基因的重組表達質(zhì)粒的鑒定
                2.4.1 重組真核表達質(zhì)粒的酶切鑒定
                2.4.2 重組真核表達質(zhì)粒的PCR鑒定
            2.5 DEF的制備
            2.6 轉(zhuǎn)染試劑的制備
            2.7 DEV gM蛋白在DEF中的細胞定位
            2.8 DEV gN與gM蛋白在DEF中的共定位
            2.9 熒光信號檢測
        3 結(jié)果
            3.1 DEV gM基因的擴增
            3.3 重組表達質(zhì)粒pDsRed1-N1/gM的鑒定
            3.4 DEV gM蛋白的細胞定位
            3.5 DEV gN蛋白與gM蛋白的共定位分析
        4 討論
            4.1 蛋白之間相互作用的研究方法
            4.2 DEV gN蛋白與gM蛋白的共定位分析
    第六章 基于DEV gN基因的鴨腸炎病毒PCR診斷方法的建立與優(yōu)化
        1 材料
            1.1 毒株/菌株/病料組織
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器
        2 方法
            2.1 引物設(shè)計與合成
            2.2 核酸DNA的提取
                2.2.1 病毒DNA的提取
                2.2.2 細菌核酸的提取
                2.2.3 組織DNA的提取
            2.3 DEV gN基因PCR擴增檢測DVE的建立及優(yōu)化
                2.3.1 DEV gN基因PCR擴增檢測DVE的建立
                2.3.2 DEV gN基因PCR方法的特異性檢驗
                2.3.3 DEV gN基因PCR方法的靈敏性檢驗
            2.4 DEV gN基因PCR方法的檢測病料組織
        3 結(jié)果
            3.1 DEV gN基因的PCR擴增結(jié)果
            3.2 PCR反應(yīng)的特異性
            3.3 PCR反應(yīng)的靈敏性檢測
            3.4 病料組織的PCR檢測
        4 討論
第三部分 結(jié)論
參考文獻
附錄
    1 DEV gN基因的測序圖譜
    2 DEV gM基因的測序圖譜
致謝
在攻讀碩士研究生期間已撰寫論文



本文編號：4015782