自世界首例哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆羊“多利”培育成功至今,體細(xì)胞核移植技術(shù)得到日益發(fā)展。體細(xì)胞克隆中,供體細(xì)胞的選擇是克隆能否成功的關(guān)鍵因素之一,直接影響到體細(xì)胞克隆的效率。迄今為止,已有多種體細(xì)胞如各類成纖維細(xì)胞、乳腺上皮細(xì)胞、生殖系統(tǒng)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等用作核供體進(jìn)行哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆,均獲得了成功,但普遍存在克隆效率低、成本高的難題。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是來源于中胚層的成體干細(xì)胞,廣泛存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中,具有高度增殖、自我更新和多向分化潛能。以間充質(zhì)干細(xì)胞為核供體進(jìn)行體細(xì)胞克隆,在豬、牛和狗上已獲得成功,在豬上表現(xiàn)出比常規(guī)成纖維細(xì)胞為供體的克隆效率高。迄今未見有綿羊的相關(guān)研究報(bào)道。 本文首先建立了綿羊脂肪和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞系,對(duì)其生物學(xué)特征及干細(xì)胞特性進(jìn)行了鑒定,誘導(dǎo)其分化為類神經(jīng)元、心肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞和胰島樣細(xì)胞,經(jīng)組織學(xué)染色和RT-PCR鑒定,確認(rèn)表現(xiàn)、表達(dá)了各分化細(xì)胞特有的形態(tài)特征及特異基因。在此基礎(chǔ)上,采用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞替代常用的成纖維細(xì)胞為核供體,構(gòu)建重構(gòu)胚,以成纖維細(xì)胞為對(duì)照,比較了重構(gòu)胚的早期發(fā)育能...

【文章頁數(shù)】：146 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
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縮略語表
1 引言
    1.1 間充質(zhì)干細(xì)胞的研究進(jìn)展
        1.1.1 間充質(zhì)干細(xì)胞概述
        1.1.2 間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性
        1.1.3 間充質(zhì)干細(xì)胞的多向誘導(dǎo)分化
    1.2 間充質(zhì)干細(xì)胞用作體細(xì)胞克隆供體的研究進(jìn)展
        1.2.1 哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆概述
        1.2.2 體細(xì)胞核移植機(jī)理的研究
        1.2.3 間充質(zhì)干細(xì)胞用作供體細(xì)胞的研究進(jìn)展
    1.3 間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用及存在問題
        1.3.1 間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用
        1.3.2 間充質(zhì)干細(xì)胞研究展望
    1.4 本研究的目意義及主要內(nèi)容
        1.4.1 作為基礎(chǔ)研究的理想種子細(xì)胞
        1.4.2 作為動(dòng)物體細(xì)胞克隆的供體細(xì)胞
        1.4.3 主要研究?jī)?nèi)容
2 綿羊胎兒、幼齡及成年間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
    2.1 材料與方法
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及耗材
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)方法
    2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        2.2.1 綿羊MSCs及SFCs體外培養(yǎng)特征
        2.2.2 綿羊間充質(zhì)干細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性
        2.2.3 綿羊MSCs干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子基因的檢測(cè)
    2.3 討論
        2.3.1 MSCs的分離與培養(yǎng)
        2.3.2 綿羊MSCs的生物學(xué)特性
    2.4 小結(jié)
3 綿羊間充質(zhì)干細(xì)胞的多向誘導(dǎo)分化
    3.1 材料與方法
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及耗材
        3.1.4 實(shí)驗(yàn)方法
    3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        3.2.1 組織學(xué)染色結(jié)果
        3.2.2 誘導(dǎo)分化的特異性表達(dá)基因鑒定
    3.3 討論
        3.3.1 MSC向神經(jīng)樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化一
        3.3.2 MSCs向心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化
        3.3.3 MSCs向骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化
        3.3.4 MSCs向脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化
        3.3.5 MSCs向胰島樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化
    3.4 小結(jié)
4 以MSC為核供體的重構(gòu)胚體外發(fā)育研究
    4.1 材料與方法
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及耗材
        4.1.4 實(shí)驗(yàn)方法
    4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        4.2.1 綿羊胎兒成年MSCs和SFCs的培養(yǎng)
        4.2.2 卵母細(xì)胞的體外成熟
        4.2.3 克隆胚的構(gòu)建
        4.2.4 重構(gòu)胚的體外發(fā)育
    4.3 討論
        4.3.1 卵母細(xì)胞的體外成熟
        4.3.2 供體細(xì)胞的準(zhǔn)備
        4.3.3 克隆胚胎的體外發(fā)育
    4.4 小結(jié)
5 以BMSCs為核供體的克隆綿羊研究
    5.1 材料與方法
        5.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        5.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及耗材
        5.1.4 實(shí)驗(yàn)方法
    5.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.2.1 供體細(xì)胞的培養(yǎng)
        5.2.2 卵母細(xì)胞的體外成熟
        5.2.3 克隆胚的構(gòu)建
        5.2.4 克隆胚胎的發(fā)育與胚胎移植
        5.2.5 成體干細(xì)胞克隆綿羊誕生
        5.2.6 成體干細(xì)胞克隆羊的親子鑒定
    5.3 討論
        5.3.1 動(dòng)物的胚胎移植
        5.3.2 克隆羊的親子鑒定
    5.4 小結(jié)
6 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：4014723