腸外致病性大腸桿菌(Extraintestinal pathogenic Escherichia coli, ExPEC)是一類人獸共患病病原菌,感染后可以引起人和動物的一系列臨床癥狀。其中典型的腸外感染包括尿道、生殖道感染、中樞神經系統(tǒng)感染、循環(huán)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)感染,并且感染數量逐年上升,增加了醫(yī)療成本,動物生產力下降,給社會帶來了沉重的經濟負擔。細菌多重耐藥性和生物被膜的形成,以及缺乏有效保護的疫苗,均使ExPEC的防控更加困難。在許多革蘭氏陰性菌細胞膜中,均發(fā)現有多藥抗性外排系統(tǒng)的存在,與臨床細菌多重耐藥性相關。多藥抗性外排泵(Multidrug-resistance efflux pumps)由三組分構成：位于細胞膜內膜上的轉運蛋白、位于周質間隙中的輔助蛋白、位于細胞膜外膜上的外膜蛋白,三者形成一個三聚體,由質子泵勢能供能而發(fā)揮作用。耐大腸菌素TolC (Tolerant colicin)外膜蛋白是組成革蘭氏陰性菌多藥抗性外排泵的最重要的組成成分,參與許多不同家族外排泵的形成,介導多重耐藥性的產生。近年來有研究表明TolC蛋白參與細菌的毒力和生物被膜的形成,并可參與細菌自身代謝產...

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞(ABBREVIATION)
第一章 文獻綜述
    1.1 腸外致病性大腸桿菌(EXPEC)病原學研究進展
        1.1.1 大腸桿菌簡介
        1.1.2 大腸桿菌的分群
        1.1.3 大腸桿菌分型
        1.1.4 ExPEC的毒力(相關)因子
        1.1.5 ExPEC的致病機理
        1.1.6 ExPEC的感染臨床癥狀和病理變化
        1.1.7 ExPEC感染的流行病學分析
        1.1.8 ExPEC的診斷、預防和治療
    1.2 大腸桿菌生物被膜研究進展
        1.2.1 細菌生物被膜概述
        1.2.2 生物被膜的危害
        1.2.3 大腸桿菌生物被膜形成相關因子的研究
        1.2.4 生物被膜細菌與懸浮細菌的生物學比較
        1.2.5 生物被膜的控制和消除
        1.2.6 展望或結語
    1.3 細菌多藥外排泵研究進展
        1.3.1 前言
        1.3.2 多藥外排泵的組成
        1.3.3 多藥外排泵的調控研究進展
        1.3.4 多藥外排泵AcrAB-TolC在細菌生理活動中的作用
        1.3.5 多藥外排泵抑制劑研究進展
        1.3.6 多重耐藥外排泵研究展望
    1.4 本研究的目的和意義
第二章 TolC在ExPEC生物被膜形成中的功能研究
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 菌株與載體
        2.2.2 主要試劑、主要儀器和設備
        2.2.3 大腸桿菌χ7213感受態(tài)細胞的制備
        2.2.4 質粒的小量制備
        2.2.5 tolC缺失突變株及其回復補償株的構建
            2.2.5.1 細菌基因組DNA的制備
            2.2.5.2 PCR引物設計與合成
            2.2.5.3 缺失突變株的構建
            2.2.5.4 tolC回復補償株的構建
        2.2.6 細菌生長曲線的測定
        2.2.7 試驗菌株對抗菌藥物最小抑菌濃度的測定(MIC測定)
        2.2.8 細菌生物被膜形成能力的測定
        2.2.9 細菌運動性的測定
        2.2.10 生物被膜細菌在掃描電子顯微鏡下形態(tài)觀察
        2.2.11 細菌curli菌毛和纖維素生物合成能力的測定
        2.2.12 不同滲透壓對試驗菌株生物被膜形成能力的影響
        2.2.13 不同培養(yǎng)基成分對試驗菌株生物被膜形成能力的影響
        2.2.14 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測試驗菌株基因的轉錄水平
            2.2.14.1 細菌RNA的提取
            2.2.14.2 逆轉錄反應
            2.2.14.3 實時熒光定量PCR
        2.2.15 細菌外膜完整性的透射電鏡(TEM)觀察
        2.2.16 TRANS-WELL試驗
        2.2.17 CpxR,OmpR,TolC缺失株的生物被膜形成能力比較
    2.3. 結果與分析
        2.3.1 缺失株和回補株的構建
        2.3.2 MIC測定
        2.3.3 生長曲線
        2.3.4 WT和ΔtolC菌株生物被膜形成能力比較
        2.3.5 M9培養(yǎng)基中curli菌毛和cellulose生物合成能力的比較
        2.3.6 電子掃描顯微鏡(SEM)下細菌表面形態(tài)的比較
        2.3.7 1/2M9培養(yǎng)基中生物被膜的形成能力、curli形成能力的比較
        2.3.8 在不同培養(yǎng)基成分中生物被膜形成能力的比較
        2.3.9 不同氯化鈉和蔗糖濃度對生物被膜形成的影響
        2.3.10 qRT-PCR檢測curli和cellulose合成相關基因的表達
        2.3.11 細菌外膜完整性的比較
        2.3.12 Trans-well
        2.3.13 CpxR及OmpR缺失株與TolC缺失株生物被膜形成能力的比較
    2.4 討論
    2.5 本章小結
第三章 TolC缺失對ExPEC致病性的影響
    3.1 前言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 菌株、細胞和培養(yǎng)基
        3.2.2 主要儀器和設備
        3.2.3 主要試劑
        3.2.4 curli形成能力的比較
        3.2.5 細胞感染實驗中細菌的準備
        3.2.6 細菌的細胞粘附和侵襲試驗
        3.2.7 細菌在巨噬細胞存活試驗
        3.2.9 小鼠感染試驗
        3.2.10 組織病理學觀察
        3.2.11 蛋白質組學比較
            3.2.11.1 菌體的培養(yǎng)與及破碎
            3.2.11.2 膜蛋白的提取
            3.2.11.3 蛋白定量
            3.2.11.4 雙向電泳
            3.2.11.5 凝膠染色
            3.2.11.6 凝膠圖像掃描
            3.2.11.7 膠內酶解及Ziptip脫鹽
            3.2.11.8 MaWi-TOF-TOF
    3.3 結果與分析
        3.3.1 curli菌毛形成能力的比較
        3.3.2 ΔtolC株對上皮細胞和巨噬細胞的粘附和侵襲能力下降
        3.3.3 ΔtolC株在巨噬細胞中的存活能力下降
        3.3.4 ΔtolC株在小鼠感染試驗中毒力下降
        3.3.5 組織病理學損傷比較
        3.3.6 WT菌株與ΔtolC株的外膜蛋白質組學比較
    3.4 討論
    3.5 本章小結
第四章 TolC缺失對ExPEC在高滲環(huán)境下存活能力的影響
    4.1 前言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 菌株和培養(yǎng)
        4.2.2 TolC缺失對ExPEC在高濃度的NaCl和蔗糖下存活能力的影響
        4.2.3 外排泵抑制劑CCCP對ExPEC在高滲環(huán)境下存活能力的影響
        4.2.4 CCCP對ExPEC生物被膜形成的影響
        4.2.5 活菌計數
        4.2.6 統(tǒng)計分析
    4.3 結果
    4.4 討論
    4.5 本章小結
全文總結
參考文獻
已發(fā)表文章
附錄：個人簡歷
致謝



本文編號：3975849