結核病是由結核分枝桿菌引起的一種慢性傳染病。結核病的疫情仍然非常嚴重,已成為目前全球最嚴重的公共衛(wèi)生問題之一。據WHO估計,全球約有1/3的人感染結核分枝桿菌,2012年有860萬新發(fā)病例,死亡人數為130萬。結核分枝桿菌感染宿主后會引起宿主的免疫應答反應并產生多種細胞因子。其中IFN-γ是抵抗結核分枝桿菌感染最主要的細胞因子。IFN-γ是一種Ⅱ型干擾素主要由活化T細胞、NK細胞產生,能激活巨噬細胞對結核分枝桿菌的清除具有重要意義。因此本實驗主要是研究對IFN-γ具有調控作用的結核分枝桿菌蛋白。 1.候選蛋白的選擇 本實驗以結核分枝桿菌H37Rv株為研究對象篩選出一些可能對IFN-γ具有調控作用的結核分枝桿菌脂蛋白,膜蛋白和分泌蛋白。通過生物信息學方法和結核分枝桿菌蛋白質組學的綜合考慮本實驗共選取了173個蛋白基因作為候選基因。針對這些蛋白的目的基因序列設計出使引物所帶有的酶切位點盡量相同PCR的引物。 2.候選蛋白真核表達質粒的構建 本實驗以結核分枝桿菌的基因組DNA為模板進行PCR擴增。然后將克隆得到的目的基因連接至pcDNA3.1-V5/HisB載體中,構建了相關蛋白的真核表達質...

【文章頁數】：71 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語表
第1章 文獻綜述
    1.1 結核分枝桿菌簡介
    1.2 結核分枝桿菌病的診斷和疫苗研究
    1.3 結核分枝桿菌與免疫反應
    1.4 結核分枝桿菌蛋白的研究
    1.5 Gamma干擾素的研究進展
第2章 研究目的和意義
第3章 材料與方法
    3.1 實驗材料
        3.1.1 細菌和細胞
        3.1.2 質粒構建所需材料及獲贈質粒
        3.1.3 主要試劑
        3.1.4 緩沖液及相關試劑的配制
    3.2 實驗方法
        3.2.1 細胞基因組的提取
        3.2.2 候選蛋白基因的引物設計
        3.2.3 候選蛋白基因的PCR擴增
        3.2.4 限制性內切酶酶切反應
        3.2.5 PCR產物或酶切產物的電泳檢測
        3.2.6 外源DNA片段與質粒載體的連接反應
        3.2.7 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備(氯化鈣法)
        3.2.8 連接產物的轉化
        3.2.9 重組質粒的鑒定
        3.2.10 熒光素酶報告基因實驗
        3.2.11 實時定量RT-PCR檢測基因mRNA水平
        3.2.12 Western Blot樣品制備
        3.2.13 重組蛋白的原核表達和SDS-PAGE分析
        3.2.14 原核表達重組蛋白的純化
        3.2.15 統計學方法
第4章 結果與分析
    4.1 候選研究蛋白的選取
    4.2 候選蛋白基因真核表達質粒的構建
    4.3 人源IFN-γ啟動子熒光素酶報告質粒的構建
    4.4 結核分枝桿菌相關蛋白對IFN-γ調控的篩選
    4.5 結核分枝桿菌Rv0720,Rv3623和Rv3763蛋白原核表達質粒構建及蛋白純化
    4.6 結核分枝桿菌蛋白對IFN-γ調控的檢測
第5章 討論與結論
    5.1 討論
    5.2 結論
參考文獻
附錄一 PCR擴增引物及酶切位點
附錄二 調控IFN-γ表達的結核分枝桿菌蛋白的初步篩選
致謝



本文編號：3961868