發(fā)布時(shí)間：2024-04-22 00:27

　　產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)耐熱腸毒素(STa)是造成新生幼畜、發(fā)展中國家兒童和旅行者腹瀉,甚至死亡的重要致病因子之一,給人類健康帶來嚴(yán)重威脅,也給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。STa分子量小(約2Ku),很難獲得天然純品,且天然蛋白不具有免疫原性,無法被蛋白質(zhì)染色劑染色,也不能直接包被到ELISA板上,因此無法采用SDS-PAGE法和ELISA方法對(duì)其進(jìn)行直接檢測。常規(guī)檢測方法是乳鼠灌胃試驗(yàn),不僅需要特定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,而且判定方法不夠靈敏。因此,表達(dá)具有免疫原的重組蛋白STa,制備抗STa單克隆抗體,對(duì)STa快速檢測方法的建立及免疫抗體檢測都具有重要的理論和實(shí)際意義。STa分為STh(人源)和STp(豬源或牛源)兩種亞型,本研究以STp為研究對(duì)象,表達(dá)了重組蛋白STp5-His,制備了抗STp單克隆抗體,初步建立了用于檢測STa的間接競爭ELISA方法。重組蛋白STp5-His和MBP-5STp的表達(dá)。將estp基因進(jìn)行4次串聯(lián),分別構(gòu)建estp5-his和e5stp基因片段;將estp5-his和5STp分別插入pGEX-6P-1和pMAL-c4x載體,構(gòu)建重組大腸桿菌 BL21(Ply...

【文章頁數(shù)】：60 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖３－１質(zhì)粒ｐＵＣ５７■＾沖Ｆｉｇ．３－１?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｐ＼ＪＣ５１?－ｅｓｔｐ

對(duì)基因合成的質(zhì)粒用ＢａｍＨＩ和Ｓａｉｌ雙酶切鑒定。載體大小為ｐＵＣ５７?（２７００ｂｐ），目的??片段⑵（８７ｂｐ）和＾（ｌｌｌｂｐ），由于目的片段較小，所以核酸膠圖譜只能隱約??看見，但大小于預(yù)期相符，見圖３－１所示。??ｂｐ?Ｍ?１?２??ＢＭ．ＤＬ２０００?ｐｌｕｓ?ＩＩ分....

圖３－２重組質(zhì)粒ｐＵＣ５７－ｅ５沖

對(duì)基因合成的質(zhì)粒用ＢａｍＨＩ和Ｓａｉｌ雙酶切鑒定。載體大小為ｐＵＣ５７?（２７００ｂｐ），目的??片段⑵（８７ｂｐ）和＾（ｌｌｌｂｐ），由于目的片段較小，所以核酸膠圖譜只能隱約??看見，但大小于預(yù)期相符，見圖３－１所示。??ｂｐ?Ｍ?１?２??ＢＭ．ＤＬ２０００?ｐｌｕｓ?ＩＩ分....

圖３－６純化ＳＴｐ５－Ｈｉｓ蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析??Ｆｉｇ．３－６?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｐｕｒｉｆｉｅｄ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ＳＴｐ５－Ｈｉｓ??

３．２．４重組蛋白ＳＴｐ５－Ｈｉｓ純化??重組蛋白ＳＴｐ５－Ｈｉｓ經(jīng)過切膠純化，反復(fù)凍融后，離心收集上清，即為純化蛋白，取少量??進(jìn)行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，見

圖３－８抗重組蛋白ＭＢＰ－５ＳＴｐ卵黃抗體的Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ分析??Ｆｉｇ．３－８?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ａｎｔｉ－ＭＢＰ－５ＳＴｐ?ＩｇＹ??

對(duì)誘導(dǎo)后的重組大腸桿菌Ｒｏｓｅｔｔａ／ｐＭＡＬ－ｃＡｘ－ｄｓ／ｐ進(jìn)行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。結(jié)果顯示，與??ｐＭＡＬ－ｃ４ｘ空載比對(duì)，目的蛋白大小約為５８Ｋｕ，主要以上清形式表達(dá)，命名為重組蛋白??ＭＢＰ－５ＳＴｐ，見圖３－７。對(duì)重組蛋白進(jìn)行Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ鑒定，在５８Ｋｕ....

本文編號(hào)：3961667