應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增鵝源星狀病毒(goose astrovirus,GoAstV)HLJ01株的ORF2基因,將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pET32a原核表達(dá)載體,并在大腸埃希菌BL21進(jìn)行表達(dá)。通過(guò)SDS-PAGE分析表明,重組菌誘導(dǎo)后得到大小約為106 ku的ORF2蛋白,與理論值相符。將誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白經(jīng)鎳親和層析柱純化后免疫小鼠制備多克隆抗體,并測(cè)定其抗體效價(jià)。Western-blotting結(jié)果顯示,ORF2蛋白可被鼠抗GoAstV陽(yáng)性血清識(shí)別。序列分析表明,該毒株與其他鵝源星狀病毒參考毒株的核苷酸相似性介于37.8%～99.3%之間,HLJ-1801分離株與已發(fā)表的8株鵝源星狀病毒毒株位于同一分支,表明其屬于一種新型星狀病毒成員。利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功高效地表達(dá)了GoAstV ORF2蛋白,融合蛋白以包涵體形式存在。本試驗(yàn)成功獲得了純化的ORF2重組蛋白和小鼠抗GoAstV多克隆抗體,為進(jìn)一步研究ORF2蛋白對(duì)星狀病毒感染的診斷試劑的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

【文章頁(yè)數(shù)】：9 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 引物設(shè)計(jì)
        1.2.2 ORF2基因的擴(kuò)增
        1.2.3 ORF2基因遺傳進(jìn)化分析
        1.2.4 重組質(zhì)粒pET32a-ORF2的構(gòu)建
        1.2.5 ORF2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定
        1.2.6 大腸埃希菌ORF2蛋白多克隆抗體制備
        1.2.7 多克隆抗體效價(jià)檢測(cè)及免疫原性鑒定
2 結(jié)果與分析
    2.1 ORF2基因擴(kuò)增產(chǎn)物
    2.2 ORF2基因核苷酸與氨基酸序列相似性分析
    2.3 HLJ01株與參考毒株ORF2基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)分析
    2.4 HLJ01與參考毒株ORF2基因氨基酸序列比對(duì)
    2.5 重組表達(dá)載體pET32a-ORF2的雙酶切鑒定
    2.6 重組蛋白的SDS-PAGE分析
    2.7 Western Blot鑒定
    2.8 多克隆抗體的制備及檢測(cè)
3 討論



本文編號(hào)：3961908